用微波辅助皂化GC－MS法测定血清中的胆固醇

摘要 研究了微波辅助皂化－气相色谱－质谱联用（GC－MS）测定血清中胆固醇的分析方法。 用0.4 mol/L KOH－甲醇溶液为皂化液, 在600 W微波功率下接受辐射30 s皂化血清样品， 选正庚烷为提取液。 通过与水浴皂化法、 酶学分光光度法比较， 表明该法快速、 溶剂用量少、 准确、 重现性好， 方法的检出限为0.011 mg， 特别适用于生物、 食品、 体液等大量样品中胆固醇的测定， 可快速为临床医学及生物工程等提供诊断数据。
关键词 微波辅助皂化， 气相色谱－质谱联用， 血清， 胆固醇
Determination of Cholesterol in Serum Sample by GC－MS
Using Microwave _ assisted Saponification
Li Gongke, He Xiaoqing, Yang Yun, Zhang Zhanxia
(Department of Chemistry, Zhongshan University, Guangzhou 510275)
Song Shaoyun, Zhang Meiyun
（Hospital of Zhongshan University, Guangzhou 510275）
Abstract A new method of microwave _ assisted saponification for the determination of cholesterol in serum sample by GC－MS is developed. The optimum conditions for saponification and extraction, such as the saponification _ solvent composition, microwave _ assisted saponification pressure and time, extraction solvent composition were studied. The experimental results were compared with those obtained by traditional methods of water _ bath heating saponification and enzymology _ spectrophotometry. The method is rapid, efficient, accurate and solvent saving. The detection limit is 0.011 mg. It is particularly suitable for the rapid determination of cholesterol in biological sample, foods and body fluid.
Keywords Microwave _ assisted saponification,Gas chromatography－mass spectrometry,Serum, Cholesterol
　　血清中胆固醇含量， 可作为酯类代谢的标志， 对糖尿病患者的预后有重要意义。 人体很多实质性的病变， 都会引起血清中胆固醇明显的变化。 因而测定血清中胆固醇含量对于临床医学具有重要意义[ 1]。 用酶学法[ 2] 测定胆固醇总量具有直接取样测定、 快速的特点， 在医学中应用较广。 气相色谱法[ 3]由于其强大的分辨率及稳定性在胆固醇的分析中受到重视， 但其最大问题是在测定之前要将样品皂化， 以使胆固醇及一些甾类不皂化物与脂肪酸及其酯分开。 目前采用最多的皂化方法是将待测物与KOH的甲（乙）醇溶液加热回流1 h[ 3]， 但由于其耗时长， 不适应于大量样品的测定。
　　由于微波能具有激活化学物质、 快速加热、 加速或选择性进行化学反应等特性， 且不破坏被测物质， 微波萃取已应用于样品的预处理[ 4]。 而微波辅助皂化用于测定血清中胆固醇国内外文献未见报道。 本文研究了微波辅助皂化(MAS)－GC－MS测定血清中胆固醇的分析方法， 通过与水浴皂化法、 酶学分光光度法比较，表明该法快速、 准确、 重现性好、 节省溶剂， 检出限为0．011 mg， 适用于生物、 食品、 体液等大量样品的测定， 可快速为临床医学及生物工程等提供诊断数据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
　　MK－1 型压力自控微波炉(上海新科微波技术应用研究所)； HP－6890气相色谱仪带质谱检测器(MSD－5973)配G1701B.02.05工作站(Hewlett－Packard, USA), 所用色谱柱为HP5－MS熔融毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm， 5％聚苯甲氧基硅氧烷＋95％聚二甲基硅氧烷)。 800型离心沉淀机(常州市园华仪器厂)； 722型分光光度计。
　　甲醇、 甲苯、 正庚烷、 KOH： 分析纯试剂（广州化学试剂厂）；
　　胆固醇标准：100 g, Holland进口100 g分装(广州化学试剂批发部）；
　　酶法试剂： 采用Aus Bio 生物工程有限公司生产的试剂盒（批号： A2130008）。
　　血清样品： 取空腹血1～2 mL， 3 000 r/min离心， 取血清标本。
1.2 GC－MS操作条件
　　色谱条件： 进样口温度240 ℃， 柱温采用程序升温， 初温140 ℃， 保持3 min后以10 ℃/min速度升至280 ℃， 恒温5 min。 载气为高纯氦气， 流速1.0 mL/min。
质谱条件： 接口温度280 ℃， EI离子源， 电子能量70 eV， 离子源温度230 ℃， 四极杆温度150 ℃， 电子倍增器电压1 500 V。 质量扫描范围30～550 u。
1.3 实验步骤
1.3.1 微波辅助皂化 量取0.5 mL血清于PTFE溶样杯中， 加入0.4 mol/L KOH－甲醇溶液5 mL， 1 mL正庚烷， 盖好密闭活塞后放入密闭溶样罐中， 旋好外盖， 置于微波炉中于600 W功率接受辐射30 s后取出， 放置流水中冷却至密闭罐中压力恢复至常压。 将皂化的溶液转移至10 mL的带盖离心管中， 用1～2 mL正庚烷分两次洗涤内衬容器， 将洗涤液合并于离心管中， 加入十九酸甲酯内标物， 振荡后将离心管置于离心沉淀机中以3 000 r/min旋转1 min后， 取上层有机相进行GC－MS分析。
1．3．2 水浴加热皂化　量取0.5 mL血清于50 mL圆底烧瓶中， 加入10 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液于60 ℃水浴加热回流1 h， 冷却后转移入10 mL离心管中， 用2 mL正庚烷分两次洗涤烧瓶， 洗液合并于离心管中， 其它步骤同上。
1．3．3 酶学分光光度法　取10 μL血清样品， 加入1 mL酶试剂盒中试剂， 混匀， 37 ℃恒温孵育5 min， 60 min内于722型光栅分光光度计上测定， 以试剂空白调零。
1．4 胆固醇的测定
　　取1 μL皂化分离出的样品溶液以20∶1的分流比用GG－MS测定胆固醇， 并制作工作曲线， 其线性范围为0～2.0 g/L， 方法的检出限为0.011 mg。
2 结果与讨论
2.1 微波参数的选择
　　样品在微波中加热主要受微波辐射功率、微波辐射时间及使用压力的影响。 MK－1型光纤自动控压微波消解系统是由光纤自动控压微波消解炉和压力自控密闭罐组成， 可实现对密闭罐内从0～4 MPa之间八档压力控制。 本实验为避免由于压力大引起的罐内反应过于剧烈及防止溶剂泄漏， 所有实验都使用第一档压力(0～0.5 MPa)。 并在此压力下研究了微波辐射功率及时间对样品皂化及萃取的影响， 结果如图1。 从图1结果可知， 在600 W微波辐射功率下加热样品0.5～2 min测得胆固醇的回收率基本一致， 且较传统回流皂化方法的稍高。 而在330 W、 198 W功率下至少分别要辐射加热1 min和2 min才能达相同效果。 这主要是由于MK－1型压力自控微波溶样系统以30 s为一个加热周期， 在一个周期内600 W， 330 W， 198 W功率的有效加热时间分别为30 s、 20 s及10 s。 为缩短辐射时间和保证每个样品有效加热时间的一致， 本法选用在600 W功率下加热30 s作为最佳实验条件。
2．2 皂化溶液及其浓度的选择
　　微波加热是通过离子导电和分子极化效应对物质直接加热， 因而样品在微波辐射条件下的受热状况除受微波功率、 压力、 及辐射时间等微波参数影响外， 还与样品基体及加入的溶液有关。 本文在600 W功率、 加热时间30 s的微波条件下分别就不同浓度KOH－甲醇溶液及KOH－乙醇溶液两个体系进行了比较实验， 结果分别列于图2及表1。 从图2可知， 0.4～1.5 mol/L KOH－甲醇溶液对测定结果影响不大， 考虑到蛋白质在较强碱性下易变性的特点， 实验选用0.4 mol/L KOH－甲醇溶液作为皂化液。 表1结果显示在600 W功率微波加热30 s的实验条件下， KOH－甲醇体系较KOH－乙醇体系好， 其相对于传统方法的回收率分别为103.2 ％、40.0 ％。 这与甲（乙）醇在微波中受热有关。 MK－1系统是以压力控制间接实现温度控制的， 与溶液气液相平衡压力对应的相平衡温度与溶液的性质有关。 因而就MK－1型微波溶样系统而言， 溶液对微波加热的影响主要表现于两个方面： 一是不同溶液对微波能的损耗， 即接收微波辐射并将微波能转变为热能的能力各不相同； 二是在控制达到相同的压力时， 不同溶液体系的温度不同[ 4]。 表1列出了几种溶液的性质及其在密闭罐中压力升到0.5 MPa时所需时间。 tan δ表示溶液将电磁能转化为热能的能力， tan δ越大， 则将电磁能转化为热能的能力越强， 也即接收微波辐射能力越强。 而溶液接收微波辐射的能力越强、 汽化热越小， 则达到预置压力所需微波加热时间也越短。 从表1可知， 甲醇的tan δ较乙醇大一倍多且汽化热较乙醇小， 因而其达到预置压力所需微波加热时间较短（分别为29 s及50 s）， KOH能较好的吸收微波能， KOH的甲（乙）醇溶液都较纯甲（乙）醇快， 分别为9 s，33 s， 因而在600 W微波功率下加热30 s， KOH－甲醇溶液能较快的达到预置压力（0.5 MPa）， 且能在预置压力下保持加热20 s左右， KOH－乙醇溶液在加热时间内不能达到预置压力而使皂化能力降低， 这与其测定值较低是一致的。

表1 几种溶剂的物理常数(频率为3 GHz， 温度25 ℃)及获得0.5 MPa压力所需的
微波辐射时间(600 W功率， 60 mL 体积溶样杯, 25 ℃)
Table 1 Physical properties（at frequency 3 GHz and temperature 25℃） and microwave radiation time needed to reach a pressure of 0.5 MPa for several solvents（600 W power and 60 mL PTFE kettle, 25 ℃）

2．3 萃取条件的选择
　　为比较溶剂在不同条件下的萃取效果， 本实验用正庚烷分别在不加水及加水条件下萃取胆固醇， 结果如表2。 结果表明： 向皂化后的样品溶液中加入适量的水， 可提高胆固醇在有机相中的分配系数， 使待测物回收率有一定提高， 但提高不大， 为避免增加干燥有机相的步骤， 本实验选用不加水的正庚烷提取后直接用GC－MS测定。
表2 不同萃取条件下胆固醇的回收结果比较
Table 2 Comparison of cholesterol recovery results in serum at various extraction conditions

2．4 微波皂化、 水浴皂化法及酶学分光光度法比较
　　本实验采用微波皂化、 传统水浴皂化及临床医学中常用的酶学分光光度法分别测定了5个血清实际样品， 同时作回收实验， 各方法的回收率均在90 ％以上， 满足分析的要求。 测定结果列于表3。 从表3结果可知， 在5个样品中， 酶学分光光度法由于胆固醇颜色反应的特异性差， 测定时往往受血清中其他因素的干扰，使结果偏高。 而水浴皂化由于加热时间长， 蛋白质易变性凝结成胶状而使胆固醇不易提取出来， 因而结果普遍偏低； 而微波皂化能在30 s内使血清样品皂化后清亮， 未发现蛋白质变性现象， 测定结果较准确。
表3 微波皂化、 水浴皂化及酶学法测定血清样品结果
Table 3 The determination results of cholesterol in serum using MAS, water _ bath heating (WBH) and enzymology

参考文献
　［1］ 宁正祥， 越谋明编著． 食品生物化学． 广州： 华南理工大学出版社， 1995． 22～34
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　［3］ Fenton M． Chromatographic separation of cholesterol in foods． J Chromatogr． 1992. 624(1－2):369
　［4］ 熊国华， 梁今明， 邹世春等． 微波萃取土壤中PAHs的研究． 高等学校化学学报， 1998， 19（10）: 1560
　［5］ 李伯骥编著． 化学化工实验师手册． 大连： 大连理工大学出版社， 1996． 129～131
　［6］ Zlotorzynski A． The application of microwave radiation to analytical and environmental chemistry． Critical Review in Anal Chem，
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