点击显示 收起
摘要 目的：为大黄泻下有效成分在体内的代谢研究提供基础研究资料。方法：大鼠口服给予大黄提取物后，依一定的时间间隔，自颈静脉采血，分离血浆，应用HPLC／MS联用技术测定其中Rhein的含晕，绘制药一时曲线。结果：口服给药后，0～6 h内，Rhein在血浆中均有分布，给药后0．5 h达到峰值。结论：Rhein血药浓度变化，可能对与其结构相似的大黄葸醌类成分体内代谢的研究具有指导意义。
关键词：液质联用；大黄酸；血药浓度测定；大黄
大黄为常用中药，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经的功效，用于实热便秘、积滞腹痛，泻痢黄疸等证，临床应用广泛。大黄的有效成分主要为蒽醌类成分，其中大黄酸(Rhein)及其葡萄糖甙类为其泻下活性的主要成分之一。本文以Rhein为指标，应用液质联用技术(HPLC／MS)，测定大鼠灌胃给掌叶大黄(Rheum palmatum L．)提取物后，血浆中Rhein含量的变化，以期为大黄泻下有效成分在体内的代谢研究提供基础研究资料。
1 仪器、试药与实验动物
SORVALL高速冷冻离心机；Satorius电子分析天平(Satorius Co．Ltd．Germany)；Perkin—Elmer Seiex API365 HPLC，配置3000 triple—quadrupole质谱检测器，PE—Sciex MassChrom工作站(version 1．0)。大黄药材取自陕西省宝鸡市大黄药材栽培基地产掌叶大黄(Rhc1MTt palmatum L．)的根及根茎，自然干燥。大黄酸对照品(Rhein)购自中国药品生物制品检定所，批号为0757—9804；内标物为联苯(化学纯)；色谱纯乙腈为Merk公司产品；纯净水为自制，其余试剂均为国产分析纯。Wistar大鼠，体重200±20 g，由香港中文大学医学院提供。
2 血药浓度测定方法
2．1 色谱条件Allitima C18色谱柱(250×4．6mm，5μm)，柱温：25℃ ；流动相：H2O：ACN(60：40)，流速为0．8 ml／min；紫外检测波长为280nm。
2．2 血浆样品预处理
精密吸取血浆样品200 μL，置5mL具塞离心试管中，加入氯仿200mL，涡旋液体混合器上振荡5 min，离心，分离有机相，37℃水浴上N2吹干，由于给不同药后大鼠血浆药物浓度差异较大，对灌胃给予大黄提取物后的血浆按上述方法处理后的残渣加入0．2 g／ml的内标液200μL，混匀后进样20 ul。
3 分析方法系统考察
3．1 方法专属性考察
在选定的条件下，大黄酸和内标物的保留时间分别在2．35 min、15．42 min，大鼠李白血浆、李白血浆加入大黄酸及内标、给药后大鼠血浆样品的色谱图见图1，表明血浆中内源性物质不干扰测定。
3．2 标准曲线的制备
准确吸取大黄酸标准溶液(100μg／m1)2、8、10、15、20、30 ttl置5mL具塞离心试管中，加入大鼠空白血浆至200μL，混匀，余同“血浆样品预处理”项下操作，以大黄酸的血药浓度为横坐标，大黄酸与内标物的峰面积比为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，每个浓度平均进行3个样本的分析，结果表明，大黄酸在2．0～30 μg／ml范围内线性关系良好，回归方程为：Y=0．21 17+0．1469X，相关系数r=0．9991，最低检测限为1．0 μg／ml。
3．3 精密度试验
3．3．1 日内精密度：分别取大黄酸标准溶液8、15、30μL，加入大鼠空白血浆至200μl，混匀，余同“血浆样品预处理”项下操作，每间隔3 h进样测定一次，共测定4次，得方法的日内精密度。
3．3．2 日问精密度：分别取大黄酸标准溶液8、15、30μl，加入大鼠空白血浆至200μl，余同“血浆样品预处惠”项下操作，每间隔24 h进样测定一次，共测定6次，得方法的日间精密度。
3．4 回收率实验
3．4．1 分析方法的回收率：分别取大黄酸标准溶液8、l5、30μl，加人大鼠空白血浆至200 l，混匀，制成低、中、高三个浓度的血浆样品，余同“血浆样品预处理”项下操作，每个浓度平行3个样本的分析，依回归方程计算测得量，按测得量与加入量之比，计算分析方法的回收率(1l=9)。
3．4．2 提取方法的回收率：分别取大黄酸标准溶液8、15、30μl，加人大鼠空白血浆至200μL，混匀，制成低、中、高三个浓度的血浆样品，余同“血浆样品预处理”项下操作，计算待测物与内标物的峰面积比A；另取相同浓度的标准溶液50 ，加入内标150μl后进样，计算待测物与内标物的峰面积比B，以B／A×100％ 计算得该浓度下药物的提取方法回收率，每个浓度平均3个样本的分析。
4 大鼠血浆中Rhein血药浓度测定
4．1 大黄提取物制备掌叶大黄干燥药材以5倍量50％ 乙醇回流提取3次，每次0．5 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至无醇昧，冷冻干燥制成粉末，密闭保存。干燥粉末用蒸馏水溶解，以吐温一80助溶，制成浓度为2 g生药／ml的混悬液，备用。
4．2 Rhein血药浓度测定 禁食12 h自由饮水大鼠l0只，取0．25 mJ空白血浆后，以剂量为500 mg／kg灌胃给予大黄提取物，于给药后不同时间(0．5、l、2、3、4、5、6、8、10 h)由颈静脉各取血O．25 ml，离心后取血浆0．1 ml，依选定的方法测定大黄酸的含量。
5 讨论
5．1 指标成分的选择 Rhein及其葡萄糖苷类成分为大黄主要活性成分之一，且含量较高，因此．选择其作为指标成分。
5．2 分析方法选择 由于实验动物存在个体差异，给药后血药浓度相差较大，因此选择与Rhein的结构较为相近的联苯作为内标，通过比较空白血浆、空白血浆加Rhein及内标、含药血浆的色谱图，表明血浆中内源性物质对样品测定无干扰，方法选择性较好；同时通过系统的方法学考察，表明本法灵敏度较高、重现性良好。
5．3 给药剂量选择 中国药典2000年版(一部)规定大黄的用量为3～30g，取用量的中剂量(14g)，按体表面积法、计算成大鼠的临床等效剂量为500mg／kg，采用该剂量测定Rhein在大鼠的血药浓度，结果较好。然而，该剂量是否适用于人的血药浓度测定，尚需实验摸索及验证。
5．4 Rhein血药浓度大黄提取物经口服给药后，在0～6 h的时间段内，Rhein在血液中均有分布，给药后0.5h达到峰值，并在给药后0.25～1.5 h时间段内，维持较高的血药浓度。由于大黄蒽类成分结构相似，由此推断其蒽类成分可能具有与Rhein较为近似的体内变化过程，因此，Rhein血药浓度变化规律，可能对与其结构相似的大黄蒽酯类成分体内代谢的研究具有指导意义。
参 考 文 献
1 焦东海，等．大黄研究．上海：上海科学技术出版社．2000：171
2 陈奇主编．中药药理实验方法学．北京：人民卫生出版计．1993：1103