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摘要：目的建立同时测定金钱草中槲皮素和山奈素两种黄酮含量的反相高效液相色谱法，用于金钱草质量标准的研究。方法ODS柱，甲醇-水-磷酸(500：500：1)的反相高效液相色谱系统。结果槲皮素和山奈素分别在3.195×0.001～0.15975μg，3.252X0.001～ 0.1626μg范围内呈良好线性关系，相关系数分别为0.9999和0.9999，平均回收率分别为97.58％和102.7％，RSD分别为1.16％和1.O1％。结论本方法简便可靠，准确，分离度好，可用于金钱草的质量控制。
关键词：反相高效液相色谱法；金钱草；槲皮素；山奈素；黄酮
金钱草为报春花科多年生草本植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的全草；清利湿热、通淋、消肿。为热淋、石淋、黄疸、疮毒之要药，煎剂有显著利尿作用，并能促进胆汁从胆管排出，有排石作用。抗菌实验对金黄色葡萄球菌有抑制作用，金钱草总黄酮及酚酸有抗炎作用。茎叶主要含酚性成分、甾醇、黄酮类、氨基酸、鞣质、挥发油、胆碱等；根含皂苷。除用聚酰胺柱分离了槲皮素和山奈素等5种黄酮类成分的报道外，对其单成分含量测定的方法在文献中少见报道。 我们应用RP-HPLC法对其中的两种黄酮成分进行含量测定，为质量标准研究提供科学依据。
1 仪器与试药
瑞士Mettler Toledo AG285电子天平；DZF-1真空干燥箱；ZQ-250 超声波清洗 器；美国安捷伦公司高效 液相色谱 仪Agilentl100 Series，配置四元泵，自动进样器(进样范围为0.1～100μ1)，紫外可见光检测器，柱温箱，在线真空脱气泵，色谱工作站等。
槲皮素和山奈素对照品均由中国药品生物制品检定所提供；金钱草购自四川，经鉴定为报春花科过路黄的全草，符合《中国药典}2000版一部规定；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2．1 色谱条件和系统适应性
色谱柱：Alltima Cl8柱(150mmX4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(500：500：1)(0.45μm微孔滤膜滤过，用前超声脱气)；检测波长：360nm；柱温：30℃：流速：1.0ml/min。
在此色谱条件下，测得槲皮素(Q)、山奈素(K)对照品贮备液和供试品溶液色谱图.
可见槲皮素(Q)峰的保留时间约为9.8 min，山奈素(K)峰的保留时间约为18.1min；图Q、K两峰与相邻峰分离度均大于1.5，理论塔板数分别为3700和6229。
2．2 溶液的配制
2．2．1 对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素(Q)和山奈素(K)对照品适量于同一量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.Olmg的混合溶液，作为对照品贮备液(Q为1.065 X 0.01mg/ml，K为1.084X 0.01 mg/ml)。
2．2．2 供试品溶液的制备
精密称取经粉碎的金钱草粉末2g于三角烧瓶中，加入25ml甲醇，超声处理30min，放冷至室温，用中速分析滤纸滤过，吸取续滤液20ml置分液漏斗中，用石油醚(20ml，15ml，15ml)萃取3次，除去其中的脂溶性杂质后，合并下层液，用乙酸乙酯-水(15：lO)混合液25ml分3次萃取，合并萃取液，回收乙酸乙酯，残渣加甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，用O.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，备用。
2．3 标准曲线的制备
倾取上述对照品贮备液置样品瓶中，以0.3、0.5、1、2,4、6、8、10、15μl体积进样，按上述色谱条件进行测定，分别以槲皮素(Q)和山奈素(K)进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，得回归方程分别为：
槲皮素(Q)：Y=37292X，r=0.9999，线性范围为：3.195×0.001～0.15975μg
山奈素(K)：Y=39597X，r=0.9999，线性范围为：3.252×0.001～0.1626μg
结果表明槲皮素(Q)和山奈素(K)分别在3.195×0.001～0.15975μg和3.252×0.001～0.1626μg范围内，对照品进样量和其峰面积积分值具有良好的线性关系。
2．4 精密度试验
精密吸取上述对照品贮备液1OμL，按“样品测定”项下方法操作，重复进样6次，结果测定Q、K峰面积积分值，RSD分别为0.30％和0.31％(n=6)。
2．5 重复性试验
取金钱草粉末，按照“供试品溶液制备”方法制备5份，按照“样品测定”项下方法操作，含量测定。
计算得Q和K的RSD分别为1.12％和0.31％(n=5)。
2．6 稳定性试验
精密吸取新制备的供试品溶液10 ，按“样品测定”项下方法在25℃温度下每隔1 h测定1次，共测定12次，记录峰面积，结果12次进样Q和K峰面积的RSD分别为1.91％和O.44％，表明供试品溶液在12h内稳定(n=12)。
2．7 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品3份，分别加入同法制备的对照品贮备液(Q为0.8224×0.001mg/ml，K为1.030×0.001 mg/ml)1.0ml、1.0ml、1.5ml，按照“供试品溶液制备”方法处理，按上述色谱条件测定.
2．8 样品测定
按“2．2．2”项方法制备金钱草供试品溶液，按上述色谱条件测定，3批样品测定结果。
3 讨论
3．1 流动相的选择。因为金钱草中的黄酮类成分含有酚羟基，呈弱酸性，故选择酸性缓冲系统。分别比较了甲醇-水-磷酸(500：500：1)系统、乙腈-水-磷酸(330：670：1)系统、甲醇-乙腈-水-磷酸(150：165：335：1)系统，结果表明后两系统在不同流速下供试品色谱峰呈现不同程度的前沿或拖尾现象。使用甲醇-水-磷酸(500：500：1)系统不但可以得到良好的峰形，而且目标峰与其相邻色谱峰的分离度良好，因此选择该系统作为流动相。
3．2 提取溶剂的选择。分别比较了甲醇、50％ 甲醇、60％甲醇、7O％甲醇及95％乙醇、5O％乙醇、60％乙醇、70％乙醇作为提取溶剂同法处理药材粉末，含量测定结果表明，选用甲醇时峰形最好，且目标物含量较高，故选用甲醇作为该方法的提取溶剂。
3．3 提取方法的选择。分别比较了4种提取金钱草粉末的方法：①超声波提取3O分钟后不经其它溶剂处理，直接过滤进样；②超声波提取3O分钟后，过滤，精密吸取续滤液1Oml，加25％盐酸15ml，回流提取3O分钟，加甲醇至50ml；③超声波提取3O分钟后，过滤，精密吸取续滤液2Oml置分液漏斗中，用石油醚(20ml、15ml、15m1)萃取3次，除去其中的脂溶性杂质后，合并下层液，用乙酸乙酯．水(15：lO)混合液25 lTl1分3次萃取，合并上层液，混匀，精密吸取10ml，加25％盐酸15ml，回流提取3O分钟，加甲醇至5Oml；④ 同“2．2”供试品溶液的制备。结果①法目标物含量虽高，但干扰较大；② 、③法目标物含量最高，但回收率不高，且考虑到黄酮苷在酸性条件下水解转化为苷元，结果要涉及到总黄酮的换算，实际工作嫌复杂；④ 法干扰小，目标物回收率较高，可以较真实的反映该生药中槲皮素、山奈素两种黄酮成分的含量，故选择④法测定。