点击显示 收起
摘要：采用以CO2为流动相的超临界流体色谱方法，以含0．05％(体积分数)三乙胺的乙醇作为改性剂，对具有重要生物功能的大豆磷脂组成进行分析，获得了大豆磷脂提取物中6个重要组分的定性结果，并讨论了流动相组成、操作温度和压力对分离的影响。对其中有代表意义的磷脂酰胆碱(PC)进行了外标法定量分析，在PC质量浓度为0．020 g／L-0．075 g／L时具有较好的线性关系，PC加样回收率为96.7％( =5)，重现性好。此方法可用于实际样品的分析。
关键词：超临界流体色谱；磷脂酰胆碱；大豆磷脂
2 实验部分
2．1 仪器与试剂
所用SFC装置由本实验室设计组装而成。Rheadyne进样器配有lOμL的定量管，Spectra 100可变波长紫外检测器为美国TSP公司产品，色谱信号由色谱工作站记录。无水乙醇、三乙胺均为国产分析纯试剂。PC，PE，PI标准品购自Sigma公司大豆磷脂分别为本实验室超临界流体抽提萃取物和北京化学试剂公司产品。
2．2 色谱条件
参考文献[2，7，8]所报道的内容，本实验所用色谱柱选择Sphefisorb C18 10μm(中科院大连化学物理研究所)，250 mm×4．6mm i．d．不锈钢柱；流动相为超临界CO2和改性剂(体积比为10：1)，其中改性剂为含0．05％(体积分数)三乙胺的乙醇溶液；流动相流速为1．1mL ／min～1．3 mL／min；柱温为3O℃～60℃ ；压力为20MPa～30MPa；进样体积为10μL；经紫外扫描，选择检测波长为214nm。
2．3 混合标准溶液和样品溶液的制备
称取各磷脂标准品适量，加人同一容量瓶中，加乙醇至刻度，配成标准品的混合溶液，其中每一标准品的质量浓度均在0．2 g／L到10．0 g／L之问；分别称取两种大豆磷脂样品1．0 g，并各自配成质量浓度约为50 g／L的乙醇溶液。
3 结果与讨论
3．1 色谱峰归属
以PE，PI和PC 标准品确定图1中的2，3，7号峰分别为PE，PI和PC ，与文献图谱 [3,9,10]比较确定4，5，8号峰分别为PS，PA和Lyso-PC。其中标准品的谱图(图l-a)中峰1为溶剂峰，粗品的谱图(图1b)中峰l则为中性脂(包括胆固醇、甘油脂等1和溶剂的合峰.
3．2 流动相组成对分离的影响
由于超临界CO2，对极性物质的溶解能力较差，在对极性化合物进行分析时往往需在其中加入极性有机溶剂(称改性剂或携带剂)， 增加流动相的溶解能力．但只用乙醇作改性剂时，分离效果难以令人满意(见图2)。当在乙醇中加入极少量的强极性物质时，分离能力有很大提高，并对峰形有较大改善。本实验采用加入0．05％三乙胺的乙醇作改性剂。
容量因子k’可以衡量化台物在固定相上保留值的大小。改性剂在流动相中的含量对分离的影响是非常明显的，即较高的改性剂浓度可缩短分析时间，但降低了相邻组分的分离选择性。
随着改性剂在流动相中的比例的提高，流动相的溶解能力加强，溶质的保留时间变短，在改性剂含量达到30％时已不能将PE与PI有效分离。
3．3 温度对分离的影响
一般情况下、温度的升高一方面会使溶质在固定相上吸／脱附加快，从而使溶质保留时间缩短；另一方面会使流动相的密度减小，而使溶辩能力减弱，溶质保留时间延长。保留时间的表观改变是两方面综合效果的体现。
如图4所示，在25 MPa、30℃ ～60℃ 时、升高温度会使各种磷脂的保留时间缩短 但随着温度的升高、这种影响越来越小，表明温度对流动相密度减小的影响在逐渐增大。值得指出的是，在30℃(低于流动相的临界温度)时也可 把各磷脂分开，表明在近临界状态下，超临界流体色谱也有良好的分离能力。
3．4 压力的影响
在二氧化碳和乙醇的体积流量比一定的情况下，尽管系统压力的升高引起了流动相中乙醇含量的微量减少，但流动相组成的微弱变化没有掩盖压力对溶质保留值的影响趋势(见图5)，即升高压力减小溶质的保留值，表明压力对溶质的保留时间的影响比较明显。
3．5 PC标准曲线
准确称取20mg PC标准品置于10mL容量瓶中，用乙醇定容。再用乙醇稀释，得到浓度分别为10mg／L，25mg／L，50mg／L，75 mg／L和100 mg／L的系列标准溶液。以上溶液均需新鲜配制。
外标峰面积定量法测定PC含量。结果表明当进样量为10 uL时，在PC质量浓度在0．020 g／L～0．075 g／L范围内，峰面积y与PC的含量x(μg)呈良好的线性关系：Y=1．187OX一0．0046，r=0．999 4。最低检出量为0．2μg(信噪比为3．5)。
3．6 PC加祥回收与重现性实验
取0．1 g大豆磷脂，精确称定，以乙醇定容为l0mL，平分为两份，其中一份加入2 mg PC标准品。用超临界流体色谱测定两份样品中的PC含量，计算加样回收率为96．7％(n=5)。其相对标准偏差(RSD)为2．8％( =5)。
3．7 应用
分别对本实验室的大豆磷脂超临界流体抽提萃取物和北京化学试剂公司的大豆磷脂产品进行了外标法测定 其中本实验室的萃取物中PC含量为53％(质量分数)，北京化学试剂公司的大豆磷脂中PC 含量为34％(质量分数)
4 结论
采用超临界流体色谱法，在适当的色谱条件下，分离了6种极性不同的磷脂，并对其中有代表意义的PC 进行了定量分析 本方法快速、简便、重现性好，可用于超临界流体萃取大豆磷脂过程中PC含量的监测以及磷脂产品的分析测定。