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摘要 研究了同时测定血清、 尿样中的咖啡因和茶碱的薄层色谱定量法。 在GF254硅胶板上, 用乙酸乙酯-氨水(V乙酸乙酯∶V氨水=96∶4)的二元展开体系能将这两种生物碱有效地分离。 其Rf值为咖啡因0.46, 茶碱0.16。 分离后的试样用薄层色谱扫描仪进行扫描定量, 测定波长272 nm, 线性范围咖啡因0.0097~1.94 μg, 茶碱0.009 0~1.80 μg。 血清及尿样的加标回收率在95.8%~106.5%之间, 相对标准偏差2.95%~3.50%。本法较为简便、 快速、 准确。
关键词 咖啡因,茶碱,薄层色谱扫描法,尿,血清
咖啡因和茶碱是同时存在于茶叶中的生物碱,它们都具有兴奋中枢神经、解热镇痛作用,在临床上应用较为广泛。有关它们的测定方法很多,而对于体液中咖啡因和茶碱的测定常用高效液相色谱法、毛细管电泳法等[1~3]。 这些方法存在对色谱分离柱的污染, 对试样的前处理要求较高,操作较复杂。 作者利用薄层色谱技术, 对展开溶剂作了筛选, 以乙酸乙酯和氨水的二元展开体系有效地分离这两种生物碱。 在分离后的硅胶板上, 用薄层色谱扫描仪扫描定量, 建立了薄层色谱扫描法同时测定咖啡因和茶碱的方法,并成功地进行了血清、 尿液试样中这两种生物碱同时测定的标准回收实验, 得到了较满意的结果。 此法未见文献报道。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
CS-9000双波长飞点薄层色谱扫描仪(日本岛津); UV-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂); 毛细管定量点样器(美国Drummoud); 硅胶GF254板(青岛海洋化工厂)。
咖啡因为中国上海生化试剂厂产生化试剂, 茶碱为上海试剂二厂产生化试剂, 其它试剂为国产分析纯试剂 。
1.2 实验方法
1.2.1 试样配制 咖啡因和茶碱标样分别用95%(φ)乙醇溶解配制, 浓度为0.01 mol/L。 使用时同时稀释,配成一系列混合标样。尿样可直接点样测定; 血清用无水乙醇沉淀蛋白, 滤过, 定容, 点样测定。
1.2.2 操作步骤 薄层板(10 cm×10 cm)使用前在110℃活化0.5 h, 取出后放入干燥器中备用。 用1 μL点样器在硅胶GF254板上点样, 标样混合液和试样点于同一板上。 然后用展开剂(V乙酸乙酯∶V氨水=96∶4)上行展开,展开后挥去溶剂, 在254 nm波长紫外灯下观察定位。 其Rf值咖啡因为0.46 ,茶碱为0.16 。 在下列仪器参数和测试条件下,用272 nm波长分别对各展开斑点逐一扫描,并记录其色谱峰积分面积, 用外标随行工作曲线法定量。
1.2.3 测定参数 线性化参数SX=7; 测定波长272 nm, 信号累加8, 平滑次数11 ,步进参数0.05 mm, 用反射吸收法锯齿扫描。在上述条件下, 对血清及尿样中试样扫描的薄层色谱图见图1。(略)
2 结果与讨论
2.1 展开剂的选择
咖啡因和茶碱的展开剂种类繁多[4], 有多种二元、 三元等不同溶剂组成的展开体系。 然而, 许多展开体系的展开效果都不很令人满意。 作者经过筛选, 确定了乙酸乙酯-氨水(V乙酸乙酯∶V氨水=96∶4)的二元展开体系。 实验表明, 该展开剂的分离效果好, 斑点小而集中, 易于扫描, 还具有毒性小, 价格低和组成简单等优点。
2.2 精密度
将同一混合标样溶液点于不同薄层板上,展开后扫描测定,依所得斑点积分面积值计算重现性。求得相对标准偏差为咖啡因4.61%,茶碱3.43%。而同板异点间相对标准偏差均低于3%, 故采用同板随行标准工作曲线法定量。
2.3 线性范围
准确配制一系列不同浓度咖啡因和茶碱的混合标准溶液,用1μL点样管点样,按上述条件展开后扫描测定。 然后分别以两者所得各斑点和积分面积值为纵坐标,点样量为横坐标绘图,这两个化合物的工作曲线均通过原点, 其分析特征见表1。
表1 咖啡因与茶碱的TLC分析特征
Table.1 The analytical characteristics of caffeine and theophylline by TLC method
Detected substance |
Linear range |
Intercept |
Slope |
r |
Caffeine |
0.0097~1.94 |
-0.0010 |
0.00147 |
0.9994 |
Theophylline |
0.0090~1.80 |
-0.0253 |
0.0193 |
0.9991 |
2.4 标准回收实验结果
本文采用随行工作曲线法,配制浓度在0.2~2 mmol/L之间, 在同板同时点加标准品, 对血清及尿样中的咖啡因和茶碱分别作了不同浓度的加标回收实验。
2.4.1 尿样中咖啡因和茶碱的标准回收实验 在25 mL容量瓶中, 同时加入1.80 g/L的茶碱标液和1.94 g/L的咖啡因标液各2 mL, 用新鲜尿液稀至刻度。 按照前述方法在硅胶板上直接点样, 展开后扫描定量。 测定结果见表2 。
表2 尿样中咖啡因和茶碱的加标回收测定结果
Table.2 Spiked result for determination of caffeine and theophylline in urine
Detected substance |
Added |
Found |
Recovery |
RSD |
Caffeine |
0.155 |
0.150 0.154 0.160 0.158 0.155 0.165 0.153 |
96.8 99.4 103.2 101.9 100.0 106.5 98.7 |
3.37 |
Theophylline |
0.144 |
0.147 0.141 0.150 0.145 0.138 0.143 0.148 |
102.1 97.9 104.2 100.7 95.8 99.3 102.8 |
2.95 |
2.4.2 咖啡因和茶碱在血清中的标准回收实验 取血清试样5 mL, 加入无水乙醇沉淀蛋白, 滤过。 在10 mL容量瓶中, 同时加入0.5 mL 10 mmol/L 的咖啡因和茶碱的标准溶液, 用上述血清试样稀至刻度。 按上述方法点样展开, 同时测定血清中咖啡因和茶碱的含量, 测定结果见表3 。
表3 血清中咖啡因和茶碱的加标回收测定结果
Table3 Spiked results for determination of caffeine and theophylline in serum
Detected |
Added |
Found |
Recovery |
RSD |
Caffeine |
0.097 |
0.098 0.094 0.096 0.097 0.101 0.102 0.096 0.099 0.094 |
101.0 96.9 98.9 100.0 104.0 105.1 98.9 102.1 96.9 |
3.2 |
Theophylline |
0.090 |
0.091 0.093 0.086 0.096 0.094 0.092 0.089 0.090 0.088 |
101.1 103.3 95.6 106.7 104.4 102.2 98.9 100.0 97.8 |
3.5 |
参考文献
1 段京莉, 严宝霞. 高效毛细管电泳测定茶碱血浓度方法的研究. 中国药学杂志, 1996, 31(2): 99
2 黄仲义, 钱基敏, 仇益群等. 高效液相色谱法测定茶碱血浓度. 药学通报, 1988, 23(7): 412
3 张 莉, 段洪瑾, 方洪钜等. 茶中儿茶素类和生物碱成分的HPLC分析,药学学报, 1995, 30(12): 920
4 陆冰真, 翟永信主编. 薄层层析法在食品分析中的应用. 北京: 北京大学出版社, 1991. 184~185