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摘要 研究了同时测定血清、 尿样中的咖啡因和茶碱的薄层色谱定量法。 在GF254硅胶板上， 用乙酸乙酯－氨水(V乙酸乙酯∶V氨水=96∶4)的二元展开体系能将这两种生物碱有效地分离。 其Rf值为咖啡因0.46， 茶碱0.16。 分离后的试样用薄层色谱扫描仪进行扫描定量， 测定波长272 nm， 线性范围咖啡因0.0097～1.94 μg， 茶碱0.009 0～1.80 μg。 血清及尿样的加标回收率在95.8％～106.5％之间， 相对标准偏差2.95％～3.50％。本法较为简便、 快速、 准确。
关键词 咖啡因，茶碱，薄层色谱扫描法，尿，血清
咖啡因和茶碱是同时存在于茶叶中的生物碱，它们都具有兴奋中枢神经、解热镇痛作用，在临床上应用较为广泛。有关它们的测定方法很多，而对于体液中咖啡因和茶碱的测定常用高效液相色谱法、毛细管电泳法等[1～3]。 这些方法存在对色谱分离柱的污染， 对试样的前处理要求较高，操作较复杂。 作者利用薄层色谱技术， 对展开溶剂作了筛选， 以乙酸乙酯和氨水的二元展开体系有效地分离这两种生物碱。 在分离后的硅胶板上， 用薄层色谱扫描仪扫描定量， 建立了薄层色谱扫描法同时测定咖啡因和茶碱的方法，并成功地进行了血清、 尿液试样中这两种生物碱同时测定的标准回收实验， 得到了较满意的结果。 此法未见文献报道。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
CS－9000双波长飞点薄层色谱扫描仪(日本岛津)； UV－I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)； 毛细管定量点样器(美国Drummoud)； 硅胶GF254板(青岛海洋化工厂)。
咖啡因为中国上海生化试剂厂产生化试剂， 茶碱为上海试剂二厂产生化试剂， 其它试剂为国产分析纯试剂 。
1.2 实验方法
1.2.1 试样配制 咖啡因和茶碱标样分别用95％（φ)乙醇溶解配制， 浓度为0.01 mol/L。 使用时同时稀释，配成一系列混合标样。尿样可直接点样测定; 血清用无水乙醇沉淀蛋白， 滤过， 定容， 点样测定。
1.2.2 操作步骤 薄层板(10 cm×10 cm)使用前在110℃活化0.5 h， 取出后放入干燥器中备用。 用1 μL点样器在硅胶GF254板上点样， 标样混合液和试样点于同一板上。 然后用展开剂(V乙酸乙酯∶V氨水=96∶4)上行展开，展开后挥去溶剂， 在254 nm波长紫外灯下观察定位。 其Rf值咖啡因为0.46 ，茶碱为0.16 。 在下列仪器参数和测试条件下，用272 nm波长分别对各展开斑点逐一扫描，并记录其色谱峰积分面积， 用外标随行工作曲线法定量。
1.2.3 测定参数 线性化参数SX=7； 测定波长272 nm， 信号累加8， 平滑次数11 ，步进参数0.05 mm， 用反射吸收法锯齿扫描。在上述条件下， 对血清及尿样中试样扫描的薄层色谱图见图1。(略)
2 结果与讨论
2.1 展开剂的选择
咖啡因和茶碱的展开剂种类繁多[4]， 有多种二元、 三元等不同溶剂组成的展开体系。 然而， 许多展开体系的展开效果都不很令人满意。 作者经过筛选， 确定了乙酸乙酯－氨水(V乙酸乙酯∶V氨水=96∶4)的二元展开体系。 实验表明， 该展开剂的分离效果好， 斑点小而集中， 易于扫描， 还具有毒性小， 价格低和组成简单等优点。
2.2 精密度
将同一混合标样溶液点于不同薄层板上，展开后扫描测定，依所得斑点积分面积值计算重现性。求得相对标准偏差为咖啡因4.61％，茶碱3.43％。而同板异点间相对标准偏差均低于3％， 故采用同板随行标准工作曲线法定量。
2.3 线性范围
准确配制一系列不同浓度咖啡因和茶碱的混合标准溶液，用1μL点样管点样，按上述条件展开后扫描测定。 然后分别以两者所得各斑点和积分面积值为纵坐标，点样量为横坐标绘图，这两个化合物的工作曲线均通过原点， 其分析特征见表1。
表1 咖啡因与茶碱的TLC分析特征
Table.1 The analytical characteristics of caffeine and theophylline by TLC method
|
Detected substance |
Linear range |
Intercept |
Slope |
r |
|
Caffeine |
0.0097～1.94 |
-0.0010 |
0.00147 |
0.9994 |
|
Theophylline |
0.0090～1.80 |
-0.0253 |
0.0193 |
0.9991 |
2.4 标准回收实验结果
本文采用随行工作曲线法，配制浓度在0.2～2 mmol/L之间， 在同板同时点加标准品， 对血清及尿样中的咖啡因和茶碱分别作了不同浓度的加标回收实验。
2.4.1 尿样中咖啡因和茶碱的标准回收实验 在25 mL容量瓶中， 同时加入1.80 g/L的茶碱标液和1.94 g/L的咖啡因标液各2 mL， 用新鲜尿液稀至刻度。 按照前述方法在硅胶板上直接点样， 展开后扫描定量。 测定结果见表2 。
表2 尿样中咖啡因和茶碱的加标回收测定结果
Table.2 Spiked result for determination of caffeine and theophylline in urine
|
Detected substance |
Added |
Found |
Recovery |
RSD |
|
Caffeine |
0.155 |
0.150 0.154 0.160 0.158 0.155 0.165 0.153 |
96.8 99.4 103.2 101.9 100.0 106.5 98.7 |
3.37 |
|
Theophylline |
0.144 |
0.147 0.141 0.150 0.145 0.138 0.143 0.148 |
102.1 97.9 104.2 100.7 95.8 99.3 102.8 |
2.95 |
2.4.2 咖啡因和茶碱在血清中的标准回收实验 取血清试样5 mL， 加入无水乙醇沉淀蛋白， 滤过。 在10 mL容量瓶中， 同时加入0.5 mL 10 mmol/L 的咖啡因和茶碱的标准溶液， 用上述血清试样稀至刻度。 按上述方法点样展开， 同时测定血清中咖啡因和茶碱的含量, 测定结果见表3 。
表3 血清中咖啡因和茶碱的加标回收测定结果
Table3 Spiked results for determination of caffeine and theophylline in serum
|
Detected |
Added |
Found |
Recovery |
RSD |
|
Caffeine |
0.097 |
0.098 0.094 0.096 0.097 0.101 0.102 0.096 0.099 0.094 |
101.0 96.9 98.9 100.0 104.0 105.1 98.9 102.1 96.9 |
3.2 |
|
Theophylline |
0.090 |
0.091 0.093 0.086 0.096 0.094 0.092 0.089 0.090 0.088 |
101.1 103.3 95.6 106.7 104.4 102.2 98.9 100.0 97.8 |
3.5 |
参考文献
1 段京莉， 严宝霞. 高效毛细管电泳测定茶碱血浓度方法的研究. 中国药学杂志， 1996， 31(2)： 99
2 黄仲义， 钱基敏， 仇益群等. 高效液相色谱法测定茶碱血浓度. 药学通报， 1988， 23(7)： 412
3 张 莉， 段洪瑾， 方洪钜等. 茶中儿茶素类和生物碱成分的HPLC分析，药学学报， 1995， 30(12)： 920
4 陆冰真， 翟永信主编. 薄层层析法在食品分析中的应用. 北京： 北京大学出版社， 1991. 184～185