高效液相色谱法测定牛黄清胃丸中绿原酸的含量

【摘要】  目的：建立牛黄清胃丸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm，流动相：甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液（pH= 2.7）（70：30，V/V），流速：1.0ml·min-1，检测波长：328nm，柱温：室温（22℃）。结果：绿原酸在0.01～0.25mg·ml-1范围内线性关系良好（r =0.9998）；平均加样回收率为98.3%， RSD=1.4%（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于牛黄清胃丸的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 牛黄清胃丸 绿原酸 含量测定

    Determination of Chlorogenic Acid in Niuhuangqinwei pills by HPLC

    【Abstract objective】To set up a method for quality control of Niuhuangqingwei pills. METHOD HPLC method was developed to quantitative determination. Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm). The mobilic phase was methanol-0.1mol phosphoric [NaH2PO4](70:30V/V).The column temperature was 22℃,the  wavelength for detection was 328nm,flow rate was 1.0ml·min-1. RESULTS  The Chlorogenic Acid; average of recovery rate was 98.3%, and RSD was 1.4%(n=6). CONCLUSION  The method is simple, accurate and suitable for its assaying.

    【Key words】HPLC; Niuhuangqingwei pills; Chlorogenic Acid; determination

    牛黄清胃丸为《卫生部药品标准》第一册（中药成方制剂）收载的品种，由牛黄、菊花、黄芩、黄柏、桔梗、麦冬等17味中药组成，具有清胃泻火，润燥通便之功效。临床用于心胃火盛、头晕目眩、口舌生疮、牙龈肿痛、乳蛾咽痛、便秘尿赤[1]，疗效良好。处方中菊花为君药之一，绿原酸为其主要有效成分，原标准中只有显微鉴别。为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定牛黄清胃丸中绿原酸的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。

    1  仪器与试药

    LC－2010A 高效液相色谱仪，CLASS－VP 色谱工作站；绿原酸对照品（批号：110753-200212），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；牛黄清胃丸为市售样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，规格6g/丸，批号：7013189，6015504，7011172）。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

    2   方法与结果

    2.1  色谱条件与系统适用性试验

    色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm, 5μm；流动相：0.1mol/L磷酸二氢钠缓冲液[取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）15.6g，加水至1000ml，制成0.1mol/L 的溶液，加入磷酸适量，使pH值为2.7]-甲醇（70：30，V/V）；检测波长：328nm；流速：1.0ml.min-1；柱温：室温（22℃）。理论板数按绿原酸峰计应不低于2500。

    2.2  溶液制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的绿原酸对照品适量置棕色量瓶中，加水制成0.1mg·ml-1的对照品溶液（10℃以下保存），即得。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取重量差异项下的牛黄清胃丸，剪碎，混匀，取约6g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流2小时，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，蒸干，残渣加三氯甲烷5ml，浸渍3分钟，弃去三氯甲烷液，残渣挥去三氯甲烷，加水适量使溶解，并转移至2ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液[2]。

    2.2.3 阴性对照溶液的制备  取除菊花以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成大蜜丸，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

    分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（绿原酸9.707min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。

    2.4  线性关系考察

    精密吸取绿原酸对照品贮备液（浓度：1.0mg·ml-1）各适量，分别置于10ml量瓶中，加水定容，配成浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg·ml-1的溶液6份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，得绿原酸的回归方程为：A=2.19×10-2C ＋1.82×10-2，r =0.9998（n=6）。结果表明，绿原酸在0.01～0.25 mg·ml-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。

    2.5  精密度和稳定性试验

    精密吸取绿原酸对照品溶液（0.10 mg·ml-1）10μl，在上述色谱条件下重复进样5次，求得绿原酸溶液峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.6%，表明精密度较好。取同一对照品溶液，在0、4、8、10、12h分别进行测定，结果表明黄芩苷对照品溶液的峰面积在12h内稳定， RSD为0.8%（n=5）。

    2.6  重复性试验

    取供试品（批号7013189），共5份，分别按“2.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液进行测定，求得绿原酸含量的RSD为1.7%（n=5），表明重复性良好。

    2.7  加样回收率试验

    精密称取已知含量的样品（批号7013189，绿原酸含量0.0472mg·g-1，平均丸重5.932g·丸-1）适量，共6份，分别精密加入绿原酸对照品溶液适量，照 “2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。

    2.8  样品含量测定

    分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定三批样品中绿原酸峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。根据三批样品所测结果，暂定每丸牛黄清胃丸的绿原酸含量质控定量限为0.20mg。 表1  绿原酸加样回收率试验表2  3批样品含量测定结果

    3  讨论

    3.1  通过对3批样品中绿原酸的测定，结果表明最高含量为0.30mg·丸-1，最低为0.28mg·丸-1 ，综合考虑确定限量每丸含绿原酸不得低于0.20mg。

    3.2  本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。

【参考文献】
  [1] 中华人民共和国卫生部药典委员会．中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂，（第一册）．38．

[2] 中国药典[S]．2005年版，一部．218．