点击显示 收起
【摘要】 目的：比较在毛细管电泳中不同中性环糊精(CD)及其衍生物对氧氟沙星对映体的手性拆分能力，并提出可能的手性识别机制. 方法：分别以αCD，βCD，γCD，HPβCD和DMβCD为手性选择剂，采用毛细管电泳法研究CD种类及其浓度、分离电压、温度对氧氟沙星对映体分离的影响. 结果：在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 3.0)，15 kV分离电压、柱温25℃的基本优化条件下，分别以25 mmol/L DMβCD或50 mmol/L HPβCD+25 mmol/L γCD为手性选择剂，氧氟沙星对映体得到基线分离，分离度(Rs)分别达2.0和1.7. 结论：CD空腔大小和空腔边缘作用对于手性识别有重要选择性，该毛细管电泳法操作简单方便，手性分离效果良好，可用于氧氟沙星对映体药物的分离.
【关键词】 电泳,毛细管；氧氟沙星；对映体；手性分离
0引言
迅速发展的毛细管电泳技术［1-2］以其高效、快速、环境友好和运行成本低等优点成为手性药物分离中最重要的技术. 目前，已有毛细管电泳分离氧氟沙星对映体的研究报道［3-6］，所用的手性选择剂包括抗生素、牛血清白蛋白、环糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物等，其研究主要集中于建立简单的分离条件，并用于氧氟沙星对映体的定性定量分析. 虽然氧氟沙星对映体的毛细管电泳分离已取得了一定的研究成果，但尚缺乏对手性分离条件的系统研究和手性识别机制的深入探索. 为此，我们以中性CD及其衍生物为手性选择剂，系统对比了5种不同的中性CD对氧氟沙星对映体的拆分能力，并较深入地讨论了各手性选择剂的可能识别机制.
1材料和方法
1.1材料
αCD，βCD，γCD，羟丙基β CD(HPβCD)，二甲基βCD（DMβCD）为美国Beckman公司产品；外消旋氧氟沙星样品为东盛集团湖北潜江制药股份有限公司产品；NaH2PO4，H3PO4（AR）购自西安化学试剂厂；其它试剂均为分析纯. P/ACETM MDQ型毛细管电泳仪系统（Beckman，USA），配有二极管阵列检测器和Beckman System Gold软件；熔融空心石英毛细管柱（50.0 μm×60.2 cm，有效长度50 cm，Beckman）；320S pH计（METTLER TOLEDO公司）.
1.2方法
毛细管柱温度25℃，工作电压15 kV，0.5psi气压进样5 s，二极管阵列检测. 背景电解质溶液为50 mmol/L，氧氟沙星样品浓度为50 mg/L. 样品溶液和缓冲液皆4℃储存，用前0.45 μm微孔滤膜滤过，且超声脱气处理. 每次运行前依次用0.1 mol/L NaOH溶液、MILLIQ去离子水、电泳缓冲液冲洗柱子2 min.
2结果
2.1中性CD手性选择剂分离对比分别采用αCD，βCD，γCD，HPβCD和DMβCD对氧氟沙星对映体进行了拆分研究，其分离度有些差异(表1).表1中性环糊精对氧氟沙星对映体的分离（略）
2.2电解质浓度、电压及柱温对分离的影响缓冲溶液浓度、分离电压对分离的选择性和效率均有较大影响，过高的电压及过高的缓冲液浓度均可能导致焦耳热增加而影响分离［7］. 以DMβCD为手性选择剂，在室温25℃并维持缓冲溶液pH 3.0（磷酸调节）的基本条件下，考察了不同缓冲液NaH2PO4浓度和操作电压对分离的影响，结果缓冲液NaH2PO4浓度为50 mmol/L，分离电压为15 kV时可使氧氟沙星对映体迁移时间、峰形理想，分离良好. 此外，本实验在15 kV电场强度下，温度在15~30℃范围内的改变对分离度无显著影响. 所以选择室温25℃为毛细管分离柱温.
2.3缓冲液pH对分离的影响缓冲溶液pH值（9.3，6.0，4.3，3.0，2.0）对分离的影响见图1，2. 在pH 9.3的碱性条件下，氧氟沙星对映体出峰时间过快（8 min），未能分离而呈现一单峰；随pH降低迁移时间延长，降低到pH 3.0时，HPβCD拆分氧氟沙星对映体的分离度(resolution, Rs)达最大，DMβCD拆分氧氟沙星对映体可达到2.0的理想Rs；而pH进一步降低时，电渗流减小，分析时间延长，且Rs呈下降趋势，所以选择pH3.0为分离酸度.
2.4手性选择剂浓度对分离的影响Wren等［8］认为在手性分离中总存在一个最佳的手性选择剂浓度，结合常数愈大，最佳浓度愈低，反之亦然. 本实验考察DMβCD（其水溶性低）在10~50 mmol/L浓度范围内,CD浓度对氧氟沙星对映体分离的影响见图3.
根据色谱基本理论［9］，当Rs大于1.5时，可以认为两个化合物达到基线分离. 以HPβCD为手性选择剂，在其和缓冲液浓度皆为50 mmol/L及25℃，15 kV的优化条件下，氧氟沙星对映体接近基线分离，Rs为1.3；进一步在HPβCD体系中加入25 mmol/L的γCD优化分离条件，结果Rs有一定提高，达到1.7（图4）（略）.
3讨论
氧氟沙星对映体的毛细管电泳手性分离已有不少报道，但关于其手性识别机制的探讨较少，本实验结果证实，在50 mmol/L NaH2PO4缓冲液(pH 3.0)、柱温25℃和分离电压15 kV的优化条件下，αCD，βCD和γCD对氧氟沙星对映体没有拆分能力；单独使用HPβCD手性选择剂，氧氟沙星对映体不能达到基线分离，但在HPβCD体系中加入适量γCD却可使氧氟沙星对映体基线分离；而只有DMβCD表现出理想的拆分效果，这表明CD空腔尺寸、边缘的特殊相互作用对氧氟沙星对映体的手性识别有密切关系.
αCD没有拆分能力可能是因为空腔环太小，不能与待测物形成有效的包合物；而γCD虽然可与氧氟沙星形成有效的包合物，但空腔环太大，将氧氟沙星分子包合的太多，对左右旋体的作用力没有区别，因此也不具有拆分能力；βCD与HPβCD和DMβCD对氧氟沙星对映体拆分能力的差异可以用βCD及其衍生物结构上的差异而导致与客体分子相互作用的不同来解释. 从结构上看，βCD及其衍生物都是由7个吡喃葡萄糖单元以α1,4键合的环状产物，但HPβCD是βCD分子大口端C2上的仲羟基被羟丙基取代的产物，而DMβCD是βCD分子大口端C2上的一个仲羟基和小口端C6上的一个伯羟基被甲基取代的产物. 氧氟沙星是由含苯环的三环与另一个六元环通过CN键相连的物质，所以当其与βCD相互作用时，分子中较小六元环可能深入βCD空腔，形成疏水包合；而苯环及分子中的F,O等原子可与βCD内腔及边缘上仲羟基形成静电、氢键和范德华作用，但因C2和C3位的仲羟基太短和空间位阻使它们不足以与手性中心相连的原子相互作用，使得左右旋体与βCD的相互作用差异很小，无法实现分离. 而HPβCD和DMβCD相当于加大了βCD分子的口径和深度，且衍生化后的CD柔性增加，使主客体分子之间的相互作用点增加，作用力增强，更易与手性中心相连的原子发生相互作用，因此HPβCD和DMβCD比βCD有更好的分离效果. 而HPβCD环上羟丙基比DMβCD环上的甲基链更长，CD环大口端更大，对氧氟沙星手性中心相连的原子的氢键作用可能更强，所以用HPβCD为手性选择剂时出峰时间比用DMβCD长；但这种强的氢键作用因CD环将氧氟沙星包合的更多，对左右旋体的识别效果不及甲基，所以HPβCD对氧氟沙星的拆分能力不及DMβCD.
我们的研究表明，在HPβCD体系中加入γCD后对映体的迁移时间较单独使用HPβCD明显延长，但这种混合体系的手性选择性大大高于单独的HPβCD体系. γCD与氧氟沙星存在作用，减小了对映体的迁移速率，增加了对映体与HPβCD的作用时间和手性识别效果. 有关HPβCD与γCD最合适的浓度之比，有待进一步研究. 关于磺化CD等带电CD拆分氧氟沙星对映体及其手性识别的机制我们正在进行研究.
【参考文献】
［1］ 许克新, 王云川. 双向电泳及质谱分析与蛋白组研究［J］. 第四军医大学学报, 2002, 23(22): 2017-2022.
［2］ Fanali S. Identification of chiral drug isomers by capillory electrophoresis［J］. J Chromatogr A, 1996, 735(12): 77-121.
［3］ Horimai T, Ohara M， Ichinose M. Optical resolution of new quinolone drugs by capillary electrophoresis with ligandexchange and hostguest interactions［J］. J Chromatogr A, 1997, 760(2): 235-244.
［4］ 俞犄，王义明，罗国安.氧氟沙星对映体的毛细管电泳手性分离［J］. 药学学报,1997, 32(3): 203-206.
［5］ 刘新宇. 高效毛细管电泳法拆分氧氟沙星对映体的研究［J］. 药学学报, 1998,33(8): 600-604.
［6］ 张智超, 张锴, 高如瑜. 以高取代磺酸基环糊精为手性选择剂毛细管电泳法拆分4种药物对映体［J］. 药物分析杂志, 2000, 20(6): 363-365.
［7］ 邓延倬, 何金兰. 高效毛细管电泳［M］.北京: 科学出版社, 2000: 45-46.
［8］ Wren SAC, Rowe RC. Theoretical aspects of chiral separation in capillary electrophoresis I. Initial evaluation of a model ［J］. J Chromatogr A, 1992, 603(12): 235-241.
［9］ 傅若农. 色谱分析概论［M］. 北京: 化学工业出版社, 2000:19.