点击显示 收起
【摘要】 运用递归渐进光谱投影法，探索中药材东北铁线莲与棉团铁线莲石油醚提取物的色谱指纹特征化学成分的异同。指纹特征数据由高效液相色谱法获得，流动相为乙腈-1‰磷酸水溶液梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温20 ℃，光谱记录范围为200～400 nm。经比较，东北铁线莲和棉团铁线莲的色谱指纹特征中，至少分别有8和6种单独的化学成分存在，两者的共有的化学成分有14种。
【关键词】 递归渐进光谱投影法; 东北铁线莲; 棉团铁线莲; 指纹特征
借助化学计量学方法分析色谱光谱二维数据中化学成分的异同，是中药指纹图谱研究的重要内容，已有光谱相关色谱、窗口目标检验因子分析、交替移动窗口因子分析等方法成功用于多种中药化学成分比较分析［1～3］。毛莨科植物东北铁线莲（Clematis manshurica Rupr）和棉团铁线莲（Clematis hex-apetala Pall）的干燥根及根茎被收载在中国药典一部中的威灵仙药材项下［4］，近年来发现具有多种药理作用［5］。中药威灵仙的指纹图谱研究，现仅涉及其挥发油部分［6］，揭示威灵仙内在化学成分本质的差异，对相关的药学深入研究与临床使用有重要的意义。递归渐进光谱投影是新近提出的一种化学计量学多元分辨方法，可用于二维色谱数据重叠峰浓度窗口的确认［7］。本研究将递归渐进光谱投影法用于不同色谱指纹特征的化学成分的异同的分析，比较东北铁线莲和棉团铁线莲石油醚提取物的指纹图谱HPLC-DAD二维数据，发现东北铁线莲和棉团铁线莲石油醚提取部分中共有的化学成分有14种，两者单独的化学成分分别有8种和6种，东北铁线莲中较棉团铁线莲含有较多的齐墩果酸。实验结果为进步确定两种药材石油醚提取物中的化学成分及相关的药学研究奠定基础。
1方法原理
设A和B分别为经色谱-光谱联用采集的两种中药样品的色谱指纹图谱的数据矩阵，矩阵的大小均为M ×N 阶，它们行的方向表征了色谱的流出信息（M个流出时间点），列的方向表征了光谱信息（N个吸收波长）。选择A中某一指纹特征峰的测定数据矩阵片断X，用渐近因子分析方法分别前向计算和反向计算获得其秩图［8］，根据秩图给出的组分数m，在A中设定m个前向和反向信息区。从第一信息区，选取一列数据作为代表性光谱s1 ，按设定的窗口尺寸w，从样品B中数据矩阵片断Y自色谱起始时间取w行子矩阵Y1 ，计算投影残差r1 1 : r1 1 =s1 T （I-Y1 Y1 + ）s1 （1）其中I为N阶单位方阵，“T”表示矢量的转置，“+”表示矩阵的广义逆;移动1个色谱时间点窗口，计算投影残差r'2 ;不断移动窗口，运算至Y的色谱终点，得一系列投影残差r11 ，r1 2 ，…，r1 i ，…，r1 n 。由第二信息区，选取代表性光谱s2 ，对Y计算一系列投影残差r2 i =s2 T （I-Y2 Y2 + ）s2 。其中矩阵Y2 由样品数据Y子矩阵Y1 和光谱s1 构成:Y2 =［Y1 ， s1 ］（2）对每一信息区j，选取代表性光谱sj ，按Yj =［Y1 ， sj-1］计算一系列投影残差rj i =sj T （I-Yj Yj + ）sj 。以得到的m个投影残差矢量对n个保留时间作图，判定两样品中化学成分的异同。当在某一保留时间i处，样品B中含有样品A中的化学成分，rj i 的数值必将接近于零，反之，在该保留时间点样品B中缺少样品A中的化学成分。同理，以样品B为基准进行因子分析，选取代表性光谱，对样品A计算投影残差，可判定A中有无B中的化学成分。
2实验部分
2.1仪器与试剂 高效液相色谱仪:HP1100型，包括Agilent1100四元泵，HP1100二极管阵列检测器，HP色谱化学工作站（美国安捷伦科技公司）。东北铁线莲、棉团铁线莲:2005年9月采自伊春市亮子河林区，按中国药典2005版一部相关项下鉴别为药典规定的相应品种。齐墩果酸对照品（110709-200304）购自中国药品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯;无水乙醇、盐酸与石油醚（60～90℃）为分析纯。
2.2样品制备
2.2.1对照品溶液 取齐墩果酸对照品约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇适量使其溶解，加甲醇至刻度。制成1mg/ml 的齐墩果酸对照品溶液。
2.2.2供试品溶液 东北铁线莲及棉团铁线莲的干燥根和根茎，经粉碎后，分别过5号（180±7.6μm）药筛。分别取药材粉末1g，加乙醇50ml，加热回流2h，滤过，滤液浓缩至约20ml，加盐酸3ml，加热回流1h，加水10ml，放冷，加石油醚振摇提取3次，石油醚用量分别为20ml、10ml、10ml，蒸干石油醚，残渣用1ml甲醇溶解，经0.45 μm油性微孔滤膜过滤，制成东北铁线莲及棉团铁线莲的供试品溶液。
2.2.3空白溶液 取乙醇50ml，同供试品溶液制备方法，加热回流提取，石油醚残渣加甲醇1ml溶解制得。
2.3指纹图谱获取
2.3.1色谱条件 色谱柱:Eclipse XDB-C18柱（250 mm× 4.0mm ID，5 μm），保护柱:Zorbax SB-C18柱（12.5mm× 4.6mm ID，5 μm）;流动相:乙腈（A）-1‰磷酸水溶液（B）作梯度洗脱，0min，25%A-75%B，保持5min;30min，85%A-15%B，保持10min;45min，100%A，保持15min。流速:1.0ml /min;柱温:20 ℃;检测波长与参比波长分别为210nm与400nm，相应谱带宽分别为4nm与50nm;进样量为20μl。
2.3.2指纹图谱 取齐墩果酸对照品溶液、空白溶液、东北铁线莲及棉团铁线莲供试液，分别按2.3.1项下的色谱条件进行检测。根据齐墩果酸对照品色谱与空白溶液的色谱确定齐墩果酸与空白峰，见图1a和图1b。选取两种铁线莲色谱中的齐墩果酸色谱峰为参照物峰，结合空白色谱峰，按国家药品监督管理局的中药注射剂色谱指纹图谱研究技术要求（暂行）规定的检测方法与相关内容制备指纹图谱，结果分别见图2a和2b。
2.4数据分析在色谱仪上间隔2 nm记录采集东北铁线莲与棉团铁线莲色谱光谱二维数据，并选取各色谱中与参照物峰峰面积比大于2%的色谱峰作为比较分析的目标峰。以棉团铁线莲作为被比较的样品，按方法原理，从东北铁线莲的色谱光谱数据中的相应信息区内分别选取光谱，计算棉团铁线莲的数据投影残差并绘图，判定相同的化学成分是否存在以及在色谱指纹图谱中的位置。将东北铁线莲作为被比较的样品，比较计算、判定有无棉团铁线莲的化学成分，从而完成色谱指纹图谱化学成分存在与否的判别。
s-齐墩果酸 1，2-空白色谱峰
图1 齐墩果酸对照品 （a）和空白溶液（b）色谱图（略）
图2 东北铁线莲（a）与棉团铁线莲（b）的色谱指纹图（略）
3结果与讨论
表1 东北铁线莲与棉团铁线莲的化学成分保留时间（略）
3.1两种铁线莲的比较 交替比较计算分析东北铁线莲与棉团铁线莲色谱-光谱数据，得到两色谱指纹图谱中各化学成分和峰位结果如表1。由表1可知，东北铁线莲及棉团铁线莲分别有22及20个化学成分，至少有8个化学成分存在于东北铁线莲中，而在棉团铁线莲色谱指纹图谱中未发现，棉团铁线莲至少有6个化学成分在东北铁线莲中未发现。色谱指纹图中东北铁线莲43.61 min与棉团铁线莲43.22 min处的色谱峰为齐墩果酸色谱峰。与棉团铁线莲比较，齐墩果酸在东北铁线莲中的含量较高。
3.2空白溶液色谱峰空白溶液的色谱图1b显示，空白溶液在35.20min与 52.30min 处有两个不可忽略的色谱峰。另由图2可知，东北铁线莲及棉团铁线莲的色谱在相对应的保留时间处，均有一定强度的色谱峰。两种铁线莲色谱光谱所涉及的空白色谱峰处数据秩图表明，第1与第2个色谱峰的成分数分别为1和2。分别用空白溶液峰1和峰2的光谱，对两种铁线莲涉及的色谱峰处的数据作窗口移动正交投影、计算投影残差，结果得到东北铁线莲与棉团铁线莲在保留时间35.18min及 52.24min 处色谱峰的光谱，与空白溶液色谱峰的光谱相同，可断定为是由样品制备的溶剂而引入，而在保留时间东北铁线莲与棉团铁线莲52.32、52.54min处重叠色谱峰中有空白溶剂峰2。
3.3化学成分的比较实验结果表明，递归渐进光谱投影不仅可用于二维色谱数据重叠峰浓度窗口的确认，而且可用于不同色谱指纹特征的化学成分异同的比较分析。东北铁线莲与棉团铁线莲含有较多的相同化学成分，这些成分与威灵仙药理作用的联系，需要深入的相关药学研究加以证实。另外，由于实验中色谱特征的光谱数据为紫外光谱，仅能在一定的程度上判定不同色 谱指纹特征的化学成分的异同，无法确定化学成分归属。递归渐进光谱投影法及本实验的色谱条件可供液-质的二维数据的获取，以便分析确认色谱指纹特征的化学结构。东北铁线莲与棉团铁线莲色谱指纹特征可用于相关药材的质量控制。
【参考文献】
1Li BY， Hu Y， Liang YZ， et al. Spectral correlative chromatogra-phy and its application to analysis of chromatographic fingerprints of herbal medicines. J Sep Sci，2004，27:581～588.
2 Zeng ZD， Liang YZ， Xu CJ. Comparing chemical fingerprints of herbal medicines using modified window target-testing factor analy-sis. Anal Bioanal Chem， 2005，381:913～924.
3 Zeng ZD， Liang YZ， Wang YL， et al. Alternative moving window factor analysis for comparison analysis between complex chromato-graphic data. J Chromatogr A，2006，1107:273～285.
4 国家药典委员会. 中华人民共和国药典，2005版一部. 北京:化学工业出版社，2005:175.
5 王亚，张彦，孙玉军. 中药威灵仙研究. 中药材，2006， 29（5）:513～515.
6 曾映旭，赵晨曦，梁逸曾，等. 中药威灵仙的化学模式识别研究. 计算机与应用化学，2006，23（9）:825～828.
7 Chen ZP， Morris J， Martin E， et al. Recursive evolving spectral projection for revealing the concentration window of overlapping peaks in two-way chromatographic experiments. Chemometr Intel Lab syst， 2004，72:9～19.
8 Maeder M， Zuberbuehler AD. The resolution of overlapping chro-matographic peaks by evolving factor analysis. Anal Chim Actor，1986，181:287～291.