高效液相色谱法测定连翘败毒丸中连翘苷的含量

【摘要】  目的：建立连翘败毒丸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm，5μm。流动相：乙腈-水（25︰75 V/V）。流速：1.0ml·min－1。检测波长：230nm，柱温30℃。结果：连翘苷在0.005～1.0mg·ml－1范围内线性关系良好（r=0.9999）；平均加样回收率为96.7%，RSD=2.7%（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于连翘败毒丸的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 连翘败毒丸 连翘苷 含量测定

    Determination of Forsythin content in Lianqiao baidu Pills by HPLC

     　　【Abstract】Objective:To set up a method for quality control of lianqiao baidu Pills.Method: HPLC method was developed to quantitative determination.COLUMN Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm,5μm.The mobilic phase was acetonifrile-water(25︰75 V/V).The column temperature was 30℃,the wavelength for detection was 230nm,flow rate was 1.0ml·min－1.RESULTS:The paeonol average of recovery rate was 96.7%,and RSD was2.7%(n=6).CONCLUSION:The method is simple ,accurate and suitable for its assaying.

    　　【Key words】HPLC;lianqiao baidu Pills;Forsythin;determination

    　　连翘败毒丸为《卫生部药品标准》第二十册（中药成方制剂）收载的品种，由连翘、金银花、苦地丁、天花粉等19味中药组成，具有清热解毒、散风消肿之功效。临床用于脏腑积热、风热湿毒引起的疮疡初起、红肿疼痛、憎寒发热、风湿疙瘩、遍身刺痒、大便秘结[1]。处方中连翘为君药，连翘苷为其主要有效成分，原标准中无含量测定方法。为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定连翘败毒丸中连翘苷的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。

    1  仪器与试药

    　　LC-2010A高效液相色谱仪，CLSAA-VP色谱工作站，紫外检测器；连翘苷对照品（批号：110821-200406），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；连翘败毒丸为市售样品（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，规格6g/袋，批号：6082655；呼伦贝尔哈慈制药厂，规格6g/100粒，批号：20051201，20051205）。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件与系统适用性试验  色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm，5μm。流动相：乙腈-水（25︰75 V/V）。检测波长：230nm；流速：1.0ml·min－1；柱温30℃。

    2.2  溶液制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的连翘苷对照品适量，加甲醇制成0.10mg·ml－1的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液适量，加甲醇制成0.05mg·ml－1的对照品溶液，即得。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取重量差异项下的连翘败毒丸10g，研碎，混匀，取约6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取5次，每次20ml，合并三氯甲烷液，回收至干。残渣用50%甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，或滤过，取续滤液，即得。

    2.2.3  阴性对照溶液的制备  取除连翘以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成丸，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

    2.3  专属性试验  分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上有相同保留时间（连翘苷16.290min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。

    2.4  线性关系考察  精密吸取连翘苷对照品贮备液（浓度：0.10mg·ml－1）适量，分别置于10ml量瓶中，加甲醇定容，配成浓度分别为0.005、0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mg·ml－1的溶液6份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，得连翘苷的回归方程为：A=48148500.13C＋25281.19，r=0.9999（n=6）。结果表明，连翘苷在0.005～0.1mg·ml－1 范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。

    2.5  精密度与稳定性试验  精密吸取连翘苷对照品溶液（0.05mg·ml－1）10μl，在上述色谱条件下重复进样6次，求得连翘苷溶液峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.7%（n=6），表明精密度较好。取同一对照品溶液，在0、4、8、12、24、48h分别进行测定，结果表明连翘苷对照品溶液在48h内稳定，RSD为0.8%

    （n=6）。

    2.6  重复性试验  取供试品（批号6082655）共6份，分别按“2.2.2 供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行测定，求得连翘苷含量的RSD为1.1%（n=6），表明重现性较好。

    2.7  加样回收率试验  精密称取已知含量的样品（批号：6082655，连翘苷含量0.06mg·g－1，平均重量6.003g·袋－1）适量，共6份，分别置具塞锥形瓶中。分别精密加入连翘苷对照品贮备液（0.1mg·ml－1）各2ml，按“2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。

    2.8  样品含量测定  分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定三批样品中连翘苷峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。表1       连翘苷加样回收率试验表2  3批样品含量测定结果

    3  讨论

    3.1  通过对3批样品中连翘苷的测定，结果表明最高含量为0.36mg·6g－1，最低为0.28mg·6g－1，综合考虑确定限量每6g含连翘苷不得低于0.20mg。

    3.2  流动相的选择  试验中采用不同的流动相甲醇-水（25︰75），乙腈-水-冰醋酸（25︰75︰0.5）。结果表明采用流动相乙腈-水（25︰75）的色谱图基线较稳。

    3.3  本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。