高效液相色谱法测定牛黄清火丸中黄芩苷的含量

【摘要】  目的：建立牛黄清火丸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Thermo ODS-2HYPERSIL C18（4.6mm×250mm，5μm），流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（45：55，V/V），流速：1.0ml·min-1，检测波长：312nm，柱温：30℃。结果：黄芩苷在0.01～0.06mg·ml-1范围内线性关系良好（r =0.9996）；平均加样回收率为99.06%， RSD=0.8%（n=9）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于牛黄清火丸的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 牛黄清火丸 黄芩苷 含量测定

    Determination of Baicalin in Niuhuangqinghuo pills by HPL

    　　【Abstract objective】To set up a method for quality control of Niuhuangqinghuowans. METHOD HPLC method was developed to quantitative determination. COLUMN C18-Thermo ODS-2HYPERSIN(4.6mm×250mm,5μm).The mobilic phase was methanol-0.4%phosphoric acid solution (45:55V/V).The column temperature was 30℃,the  wavelength for detection was 312nm,flow rate was 1.0ml·min-1. RESULTS  The Baicalin average of recovery rate was 99.06%, and RSD was 0.8%(n=9). CONCLUSION  The method is simple, accurate and suitable for its assaying.

    　　【Key words】HPLC；Niuhuangqinghuo pills；Baicalin；determination

    　　牛黄清火丸为《卫生部药品标准》第七册（中药成方制剂）收载的品种，由黄芩、桔梗、牛黄、山药、丁香等9味中药组成，具有清热、散风、解毒之功效。临床用于肝胃肺蕴热引起的头晕目眩，口鼻生疮，风火牙痛，咽喉肿痛，痄腮红肿，耳鸣肿痛[1]，疗效良好。处方中黄芩为君药，黄芩苷为其主要有效成分，原标准中只有显微鉴别和薄层色谱。为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定牛黄清火丸中黄芩苷的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。

    1  仪器与试药

    　　LC－2010A 高效液相色谱仪，CLASS－VP 色谱工作站；黄芩苷对照品（批号：110715-200212），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；牛黄清火丸为市售样品（哈药集团世一堂制药厂，规格3g/丸，批号：0604158，0604272，0605126）。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件与系统适用性试验

    　　色谱柱：Thermo ODS-2HYPERSIN C18 (4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（45：55，V/V）；检测波长：312nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃。理论板数按黄芩苷峰计应不低于5000。

    2.2  溶液制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成0.1mg·ml-1的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液适量，加甲醇制成30μg·ml-1的对照品溶液，即得。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取重量差异项下的牛黄清火丸，剪碎，混匀，取约1g，精密称定，加70%乙醇30ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液[2]。

    2.2.3  阴性对照溶液的制备  取除黄芩以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成大蜜丸，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

    2.3  专属性试验

    　　分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（黄芩苷11.850min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。

    2.4  线性关系考察

    　　精密吸取黄芩苷对照品贮备液（浓度：0.1mg·ml-1）各适量，分别置于10ml量瓶中，加甲醇定容，配成浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg·ml-1的溶液6份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，得黄芩苷的回归方程为：A=28905511.43C－4455.07，r =0.9996（n=6）。结果表明，黄芩苷在0.01～0.06 mg·ml-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。

    2.5  精密度和稳定性试验

    　　精密吸取黄芩苷对照品溶液（0.03 mg·ml-1）10μl，在上述色谱条件下重复进样5次，求得黄芩苷溶液峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.8%，表明精密度较好。取同一对照品溶液，在0、4、8、12、24h分别进行测定，结果表明黄芩苷对照品溶液的峰面积在24h内稳定，RSD为0.7%（n=5）。

 2.6  重复性试验

    　　取供试品（批号0604158），共5份，分别按“2.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行测定，求得黄芩苷含量的RSD为0.9%（n=5），表明重复性良好。

    2.7  加样回收率试验

    　　精密称取已知含量的样品（批号0604158，黄芩苷含量9.03mg·g-1，平均丸重2.901g·丸-1）适量，共9份，分别精密加入低、中、高3种不同浓度的黄芩苷对照品适量，照 “2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。

    2.8  样品含量测定

    分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定三批样品中黄芩苷峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。根据三批样品所测结果，暂定每丸牛黄清火丸的黄芩苷含量质控定量限为25mg。表1             黄芩苷加样回收率试验

    3  讨论

    3.1  通过对3批样品中黄芩苷的测定，结果表明最高含量为27.10mg·丸-1，最低为26.09mg·丸-1 ，综合考虑确定限量每丸含黄芩苷不得低于25mg。

    3.2  流动相的选择 试验中曾反复试用过不同比例的甲醇和不同浓度的磷酸溶液作为流动相进行分离，结果甲醇-0.4%磷酸溶液（45︰55，V/V）能使样品峰与相邻杂质峰达到基线分离。

    3.3  本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。