高效液相色谱法测定咽炎片中哈巴俄苷的含量

【摘要】  目的：建立咽炎片的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Agilent TC-C18 （250mm×4.6mm，5μm），流动相：乙腈-1%醋酸溶液线性梯度洗脱，流速：1.0ml·min-1，检测波长：278nm，柱温：40℃。结果：哈巴俄苷在1.0～50.0μg·ml-1范围内线性关系良好（r=0.9997）；平均加样回收率为98.1 %， RSD=1.9 %（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于咽炎片的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 咽炎片 哈巴俄苷 含量测定

    Determination of Harpagoside content in Yanyan tablets by HPLC

    　　【Abstract】Objective：To set up a method for quality control of Yanyan tablets. METHOD HPLC method was developed to quantitative determination. Agilent TC-C18 （250mm×4.6mm，5μm）.The mobilic phase was acetonitrile-1% acetic acid solution in linear gradient elution.The column temperature was 40℃,the  wavelength for detection was 278nm ,flow rate was 1.0ml·min-1. RESULTS  The Harpagoside average of recovery rate was 98.1%, and RSD was 1.9%(n=6). CONCLUSION  The method is simple, accurate and suitable for its assaying.

    　　【Key words】HPLC; Yanyan Tablets; Harpagoside; Determination

    　咽炎片为《卫生部药品标准》第二册（中药成方制剂）收载的品种，由玄参、百部（制）、天冬、牡丹皮、麦冬、款冬花（制）、木蝴蝶、地黄、板蓝根、青果、蝉蜕、薄荷油12味中药组成，具有养阴润肺、清热解毒、清利咽喉、镇咳止痒之功效。临床用于慢性咽炎引起的咽干、咽痒、刺激性咳嗽等症，疗效良好[1]。处方中玄参为主药，哈巴俄苷为其主要有效成分，原标准中只有显微鉴别和化学鉴别。为了更好地控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定咽炎片中哈巴俄苷的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。

    1  仪器与试药

    　　LC－2010C 高效液相色谱仪，CLASS－VP 色谱工作站，检测器为紫外检测器；哈巴俄苷对照品（批号：111730-200501），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；咽炎片为市售样品（吉林吉尔吉药业有限公司，批号：20070501，长春海外制药集团有限公司，批号：20070109、20070503，吉林市吴太感康药业有限公司，批号：060413、060414，上述规格均为0.25g·片-1）乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件与系统适用性试验

    　　色谱柱：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以1%醋酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长278nm；流速：1.0ml·min－1；柱温：40℃。理论板数按哈巴俄苷峰计应不低于5000。表1    流动相梯度洗脱程序

    2.2  溶液制备

    2.2.1  对照品溶液的制备  精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的哈巴俄苷对照品适量，加30%甲醇制成50μg·ml－1的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液适量，加30%甲醇制成10μg·ml－1的对照品溶液，即得。

    2.2.2  供试品溶液的制备  取咽炎片20片，除去包衣后精密称定，研细，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇50ml，密塞，称定重量，浸泡1小时后超声处理（功率500W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液[2]。

    2.2.3  阴性对照溶液的制备  取除玄参以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成片，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

 2.3  专属性试验  分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上有相同保留时间（哈巴俄苷16.110min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。

    2.4  线性关系考察  精密吸取哈巴俄苷对照品贮备液（浓度：50μg·ml－1）各适量，分别置10ml量瓶中，加30%甲醇定容，配成浓度分别为1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0μg·ml－1的溶液6份，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，得哈巴俄苷的回归方程为：A=33961258.5C＋1836.7，r=0.9997(n=6)。结果表明，哈巴俄苷在1.0～50.0μg·ml－1范围内峰面积与其浓度呈良好的线性关系。

    2.5  精密度试验  精密吸取哈巴俄苷对照品溶液（10μg·ml－1）10μl，在上述色谱条件下重复进样5次，求得哈巴俄苷溶液峰面积的RSD为0.3%（n=5），表明精密度较好。

    2.6  稳定性试验  精密吸取哈巴俄苷对照品溶液（10μg·ml－1）10μl，在0、6、12、18、24h分别进行测定。结果表明哈巴俄苷对照品溶液在24h内稳定，

    RSD为0.6%（n=5）。

    2.7  重复性试验  取供试品（长春海外，批号：20070109）共5份，分别按“2.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，进行测定，求得哈巴俄苷含量的RSD为了1.3%（n=5），表明重复性良好。

    2.8  加样回收率试验  精密称取已知含量的样品（长春海外，批号：20070109，哈巴俄苷含量116μg·g－1，平均片重0.2417g·片－1）适量，共6份。分别精密加入哈巴俄苷对照品贮备液适量，照“2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表2。

    2.9  样品含量测定  分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定五批样品中哈巴俄苷峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表3。根据五批样品所测结果，暂定咽炎片中哈巴俄苷含量质控定量限为18μg·片－1。表2    哈巴俄苷加样回收率试验表3     5批样品含量测定结果

    3  讨论

    3.1  流动相的选择  试验中曾反复试用过不同比例的乙腈和不同浓度的醋酸溶液作为流动相进行分离，结果采用乙腈-1%醋酸溶液线性梯度洗脱，能使样品峰与相邻杂质峰达到基线分离。

    3.2  通过对5批样品中哈巴俄苷的测定，结果表明最高含量为33μg·片－1，最低为24μg·片－1，综合考虑暂定咽炎片每片含玄参以哈巴俄苷（C24H30O11）计，不得少于18μg。

    3.3  本方法结果准确，方法简便，重复性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。

【参考文献】
  [1] 卫生部药品标准[S]．中药成方制剂，第二册，1990，161．

  [2] 中国药典[S]．2005年版，一部，76～77．