高效液相色谱法测定化毒丸中连翘苷的含量

【摘要】  　　目的：建立化毒丸的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm，5μm。流动相：乙腈-水（25︰75 V/V）。流速：1.0ml·min－1。检测波长：230nm。柱温：30℃。结果：连翘苷在0.005～0.1mg·ml－1范围内线性关系良好（r=0.9999）；平均加样回收率为97.5%，RSD=1.6%（n=6）。结论：该方法简便易行，结果准确可靠，可适用于化毒丸的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法 化毒丸 连翘苷 含量测定

　　Determination of forsythin content in Hudu Pills by HPLC

　　【Abstract 】Objective：To set up a method for quality control of hudu pills.METHOD HPLC method was developed to quantitative determination.COLUMN Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250mm,5μm.The mobilic phase was acetonifrile-water (25︰75 V/V).The column temperature was 30℃,the wavelength for detection was 230nm ,flow rate was 1.0ml·min－1.RESULTS The paeonol average of recovery rate was 97.5%,and RSD was 1.6%(n=6).CONCLUSION The method is simple,accurate and suitable for its assaying.

　　【Key words】HPLC;Hudu pills;Forsythin;determination

　　化毒丸为《卫生部药品标准》第八册（中药成方制剂）收载的品种，由连翘、玄参、地黄、牛蒡子（炒）、桔梗13味中药组成，具有清热解毒之功效。临床用于小儿热毒实火，口舌生疮，牙龈出血，颈颊赤肿，周身长生疮疖，疹后余毒不净[1]。处方中连翘为主药之一，连翘苷为其主要有效成分，原标准中无含量测定方法。为了更好的控制制剂的内在质量，本文采用高效液相色谱法测定化毒丸中连翘苷的含量，以期为该制剂的质量提供快速、准确的测定方法，现报告如下。

　　1  仪器与试药

　　LC-2010A高效液相色谱仪，CLASS-VP色谱工作站，紫外检测器；连翘苷对照品（批号：110821-200406），由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用；化毒丸为市售样品（药都制药集团股份有限公司，规格3g·丸－1，批号：060801，060302，060517）；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件与系统适用性试验

　　色谱柱：Agilent Technologies ZORBAX Extend-C18 4.6×250nm，5μm；流动相：乙腈-水（25︰75，V/V）；检测波长：230nm；流速：1.0ml·min－1；柱温：30℃。理论板数按连翘苷峰计应不低于3000。

　　2.2  溶液制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备

　　精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时以上的连翘苷对照品适量，加甲醇制成0.10 mg·ml－1的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液适量，加甲醇制成0.05mg·ml－1的对照品溶液，即得。

　　2.2.2  供试品溶液的制备

　　取重量差异项下的化毒丸，剪碎，混匀，取约3g，精密称定，加硅藻土适量，充分搅拌均匀，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率50KHz）30分钟，放冷，再称定重量。用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取5次，每次20ml，合并三氯甲烷液，回收至干。残渣用50%甲醇溶解，转移至5mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，或滤过，取续滤液，即得[2]。

　　2.2.3  阴性对照品溶液的制备

　　取除连翘以外的处方中其余药材的十分之一量，按法制成丸，再按供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

　　2.3  专属性试验

　　分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。由图1可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间（连翘苷16.290min）的色谱峰，阴性试验无干扰，证明本法可行。

　　2.4  线性关系考察

　　精密吸取连翘苷对照品贮备液（浓度：0.10mg·ml－1）适量，分别置于10ml量瓶中，加甲醇定容，配成浓度分别为0.005、0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mg·ml－1的溶液6份，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤。精密吸取续滤液各10μl，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，得连翘苷的回归方程为：A=48148500.13 C ＋25281.19，r=0.9999（n=6）。结果表明，连翘苷在0.005～0.1mg·ml－1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系。

　　2.5  精密度试验

　　精密吸取连翘苷对照品溶液（0.05mg·ml－1）10μl，在上述色谱条件下重复进样6次，求得连翘苷溶液峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.7%（n=6），表明精密度较好。

　　2.6  稳定性试验

　　精密吸取连翘苷对照品溶液（0.05mg·ml－1）10μl，在0、4、8、12、24、48h分别进行测定，结果表明连翘苷对照品溶液在48h内稳定，RSD为0.8%（n=6）。

　　2.7  重复性试验

　　取供试品（批号：060801）共6份，分别按“2.2.2供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液进行测定，求得连翘苷含量的RSD为1.3%（n=6），表明重现性较好。

　　2.8  加样回收率试验

　　精密称取已知含量的样品（批号：060801，连翘苷含量0.24mg·g－1，平均丸重0.298g·丸－1）适量，共6份，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入连翘苷对照品贮备液（0.1mg·ml－1）各4ml，按“2.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。表1 连翘苷加样回收率试验（略）

　　2.9  样品含量测定

　　分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定三批样品中连翘苷峰面积，按外标法计算其含量（n=5），结果见表2。表2 3批样品含量测定结果（略） 

　　3  讨论

　　3.1  通过对3批样品中连翘苷的测定，结果表明最高含量为0.72mg·丸－1，最低为0.68mg·丸－1，综合考虑确定限量每丸含连翘苷不得低于0.5mg。

　　3.2  流动相的选择，试验中采用不同的流动相甲醇-水（25︰75），乙腈-水-冰醋酸（25︰75︰0.5），结果表明采用流动相乙腈-水（25︰75）的色谱图基线较稳[2]。

　　3.3  本方法结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，可以作为该制剂的质量控制方法。

【参考文献】
  　　[1] 卫生部药品标准中药成方制剂[S]．1993，40．

　  　[2] 中国药典[S]．2005，589～590．