反相高效液相色谱法测定细辛挥发油中甲基丁香酚及黄樟醚含量

【摘要】 目的： 以陕西洛南产北细辛为研究对象，采用反相高效液相色谱法测定细辛挥发油中甲基丁香酚及黄樟醚含量，以满足质量控制的要求. 方法： 以甲醇水（80∶20）为流动相，流速1 mL/min, 经Inertsil ODS 3(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 色谱柱分离，于250 nm波长检测. 结果： 甲基丁香酚及黄樟醚的分离效果良好. 甲基丁香酚在19.28~462.72 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=46156.59X+32840.02（r=0.9999，n=5）；黄樟醚在11.78~471.20 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=29591.52 X-75017.20（r=0.9999，n=5）. 甲基丁香酚和黄樟醚的平均回收率分别为99.95%和100.03%，相对标准偏差分别为0.97%和0.68%. 结论： 本法可同时测定细辛挥发油中甲基丁香酚及黄樟醚的含量，为质量控制提供依据，方法简便、快速，准确。

【关键词】 反相高效液相色谱 细辛挥发油 甲基丁香酚 黄樟醚

　　0引言

　　细辛主要有效成分为挥发油，甲基丁香酚和黄樟醚是挥发油中的主要成分. 甲基丁香酚有麻醉和镇痛作用，黄樟醚为广谱抗霉菌成分. 但文献报道［1-2］，两者的代谢产物均可引起大鼠的癌变. 为了控制细辛挥发油的质量，我们以陕西洛南产北细辛为研究对象，建立了HPLC法同时测定细辛挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的含量. 该法简便快速，结果准确可靠.

　　1材料和方法

　　1.1材料SHIMADZU LC2010ATH高效液相色谱仪及其色谱工作站；挥发油提取器（容量2 L，西安远志公贸有限责任公司）；电子分析天平(梅特勒公司)；北细辛（购于陕西西安市药材公司，产地陕西洛南）；甲基丁香酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：130555200501）；黄樟醚对照品（四川宜宾香料厂，含量：98.8%）；甲醇（色谱纯，Fisher公司），色谱用水为双蒸水.

　　1.2方法

　　1.2.1色谱条件色谱柱：Iinertsil ODS3(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：甲醇水（80∶20）；流速：1 mL/min；检测波长：250 nm，进样量：20 μL，温度：室温.

　　1.2.2对照品储备液及供试品溶液的制备精密称量甲基丁香酚对照品约19.28 mg，黄樟醚对照品23.56 mg，分别置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液，避光保存备用. 精密量取细辛挥发油100.05 mg置25 mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL置10 mL的量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.

　　2结果

　　2.1甲基丁香酚及黄樟醚含量测定方法建立

　　2.1.1方法专属性分别取适当浓度的甲基丁香酚对照品溶液、黄樟醚对照品溶液、供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样，记录色谱图（图1）. 从图中可以看出甲基丁香酚的保留时间为7.55 min，黄樟醚的保留时间为11.65 min，其他组分对测定无干扰.

　　A： 甲基丁香酚对照品； B： 黄樟醚对照品； C： 细辛挥发油甲醇溶液.

　　图1色谱图（略）

　　2.1.2标准曲线制备与线性考察精密量取甲基丁香酚对照品储备液0.25，0.5，1，3和6 mL，分别置于10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀. 分别吸取上述溶液20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积Y对浓度X作图，甲基丁香酚峰面积在19.28~462.72 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=46156.59 X+32840.02(r=0.9999，n=5). 精密量取黄樟醚对照品储备液0.125，0.25，0.5，1，3和5 mL，分别置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀. 分别吸取上述溶液20 μL进样，记录峰面积，以峰面积Y对浓度X作图，黄樟醚峰面积在11.78~471.20 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=29591.52 X-75017.20(r=0.9999，n=5).

　　2.1.3精密度考察取混合对照品溶液（含甲基丁香酚77.12 mg/L，黄樟醚 94.24 mg/L）同一天连续进样5次，进样量20 μL，测定峰面积，计算甲基丁香酚黄和樟醚的1 d内RSD值分别为0.22%，0.28%. 连续3 d进样5次，进样量20 μL，测定峰面积，计算甲基丁香酚黄和樟醚的3 d间RSD值分别为0.26%，0.34%. 结果表明仪器与色谱条件具有良好的精密度.

　　2.1.4稳定性试验取供试品溶液，在配制后0，4，8和24 h于同一色谱条件下分别进样，甲基丁香酚、黄樟醚峰面积的RSD分别为0.32%，0.41%. 结果表明样品溶液在室温下24 h内稳定.

2.1.5回收率实验精密称量同一批 (批号20070912) 已知含量的挥发油10 mg平行6份，分成3组，每组2份，分别加入对照品溶液(甲基丁香酚308.48 mg/L，黄樟醚282.72 mg/L) 0.25，0.5及1.0 mL. 甲醇溶解定量至 25 mL，摇匀，分别进样20 mL，记录色谱图，计算甲基丁香酚和黄樟醚的回收率（表1，2）.

　　表1甲基丁香酚的加样回收率样品取样量（略）

　　表2黄樟醚的加样回收率样品取样量（略）

　　2.2挥发油的提取及含量测定

　　2.2.1细辛挥发油的提取将1.0 kg北细辛粉碎后装入挥发油提取器中，加适量水浸润2 h，通入温度为120℃的水蒸汽，蒸汽压力0.02 kPa，蒸馏3 h，25℃冷凝回收油水混合液，过滤后经油水分离器分离，无水硫酸钠干燥后得挥发油. 挥发油为淡黄色透明油状液体，具有特殊浓郁香味，得油率约2.4%.

　　2.2.2挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的含量测定分别取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算含量（表3）. 根据以上3批样品的检测结果，陕西洛南产北细辛地下部分的挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚含量分别为529.92和5.55 mg/g.

　　表3挥发油样品中甲基丁香酚和黄樟醚含量测定结果（略）
　　
　　3讨论

　　细辛虽属常用中药，但因其毒性较大，中医早有"细辛不过钱" 的说法，我国历版药典也均规定常用量为1~3 g. 目前对细辛的毒性大小存在很大争议，但普遍认为细辛的毒性来源于所含挥发油中的主要成分甲基丁香酚和黄樟醚［3］. 现代药理学认为甲基丁香酚是细辛镇咳祛痰、镇痛和麻醉的主要成分［4］；黄樟醚有良好的抗真菌作用［5］，并且至今也未见长期接触（比如种植细辛的员工）或使用细辛而导致癌症的流行病学的报道，因此安全而有效的使用细辛的前提是建立细辛及其制品的质量控制标准.

　　细辛在传统的汤剂应用中因其用量小和以挥发油作为主要药效物质，一般在煎煮时后下，而在大剂量应用时为了减小毒性而长时间高温度煎煮以减小挥发性成分. 在现代中药制药工业中，一般先提取挥发油，在制剂工艺的最后阶段再加入挥发油，这样既可节省资源又可以保证药物的疗效. 此外，可入药的细辛品种和产地不同，总挥发油的含量差异较大，甲基丁香酚和黄樟醚的含量也有很大的差异［6-7］. 细辛地上部分含用马兜铃酸，2005版药典开始规定不使用地上部分［8］，但是地上部分也含有挥发油，为了充分利用细辛资源，利用细辛地上部分提取的挥发油开始面市. 因此建立HPLC测定细辛挥发油中的主要成分甲基丁香酚和黄樟醚的含量很有必要.

　　细辛挥发油中的主要成分甲基丁香酚和黄樟醚含量的测定主要采用气相色谱法［6,9］，我们首次采用反相高效液相色谱同时测定细辛挥发油中的甲基丁香酚和黄樟醚. 甲基丁香酚的最大吸收波长为282 nm，黄樟醚的最大吸收波长为250 nm，因挥发油中黄樟醚含量相对较低，因此在测定时选择250 nm为测定波长. 结果表明本方法简便、快速，准确. 可为建立细辛挥发油的质量控制标准提供依据.

【参考文献】
  　［1］ Johnson JD, Ryan MJ, Toft J DII, et al. Twoyear toxicity and carcinogenicity study of thyleugenol in F344/N rats and B6C3F(1) mice［J］. J Agric Food Chem, 2000, 48(8):3620-3632.

　　［2］ National Toxicology Program. NTP Toxicology and carcinogenesis studies of methyleugenol (CAS 93152) in F344/N Rats and B6C3F1 mice (Gavage Studies)［J］. Natl Toxicol Program Tech Rep Ser, 2000,491:411-412.

　　［3］ 顾苏俊. 近年来有关细辛用法用量研究的综述［J］. 中草药, 2006,37(6):956-957.

　　［4］ 周慧秋,于滨,乔婉红,等. 甲基丁香酚药理作用研究［J］. 中医药学报，2000,(2)：79-80.

　　［5］ 谢伟，陆满文. 细辛挥发油的化学与药理作用［J］. 宁夏医学杂志，1995,17(2)：121-124.

　　［6］ 周长征，杨春澍，马长华，等. 气相色谱法测定细辛挥发油中甲基丁香酚和黄樟醚的含量［J］. 中国药学杂志，1999,34（12）：836-839.

　　［7］ 杨厚玲，邱琴，陈婷婷，等. 不同方法提取的北细辛挥发油的气质联用成分分析［J］. 中国药学杂志，2007,42(13)：1031-1033.

　　［8］ 周祯祥. 细辛药用部位的变迁与思考［J］. 中医杂志，2007,48(2)：189.

　　［9］ 王栋，王喜军. 北细辛不同生长期甲基丁香酚和黄樟醚的气相色谱法定量分析［J］. 色谱，1997,15（1）：85-86.