高效液相色谱电化学法测定血清褪黑激素水平

［摘要］目的: 建立测定血清褪黑激素水平的高效液相色谱方法。 方法: 血清褪黑激素用氯仿反复萃取，氯仿层经真空干燥、氮气吹干，最后残流物溶解进样。用C18反相柱进行色谱分析，电化学检测器测定结果。 结果: 测定线性范围达1.72nmol・L -1 ，最低检测限为0.084nmol・L -1 ，日内变异4.2%～4.8%，日间变异4.4%～5.0%，方法回收率55.3%～76.5%。 结论: 本方法可用于临床实验室测定血清褪黑激素水平。
［关键词］ 褪黑激素;萃取;高效液相色谱;电化学检测

       褪黑激素（melatonin，MT）是色氨酸在松果体内经5.羟色胺和N.乙酰基转化酶作用先转化成N.乙酰.5.羟色胺，然后在O.甲基酶作用下合成。

    松果体是一个神经内分泌转换器，由它合成的松果体素即MT参与日周节律、月节律、季节节律和年节律的调节。尽管其含量较低，但却有广泛的生理作用。一些研究表明，在发育异常、失眠、抑郁综合征、癫痫、库欣综合征、乳腺癌、前列腺癌的发病过程中，MT昼夜出现异常［1］ 。新近的研究表明，MT可保护实验性糖尿病小鼠，这种作用较为显著且呈量效关系 ［2，3］ 。但MT的降血糖作用机制迄今尚不明了。目前MT已经人工合成，国外一些学者已探索用MT作为临床上治疗某些疾病的辅助药物，所以检测血清MT水平有其重要的临床意义。

    目前测定MT的技术有放射免疫法［1，4］ 、酶联免疫法（ELISA）［1，5］ 、气质联用法（GC.MC）［6，7］ 和高效液相色谱（HPLC）法［8～11］ ，但HPLC法较其它方法简单、快速、成本低。本实验在参考国外有关文献的基础上对样本处理和色谱条件进行了适当的改进，建立了HPLC测定血清MT水平的方法。

　　1 材料与方法

　　 1.1 仪器及试剂

    日本岛津LC.6A色谱仪，L.ECD.6A电化学检测器，ZORBAX色谱柱（4.6cm×25cm）及Waters Nova.pak ODS保护柱，Millipore过滤器及0.45μm的有机滤膜，MT为Sigma公司产品，乙腈（色谱纯）为江苏淮阴精细化工研究所产品，Na 2 EDTA、三氯甲烷为上海试剂一厂  产品，乙酸钠为上海试剂四厂产品，柠檬酸为上海化学试剂供应站产品，NaOH为南京化学试剂厂产品。上述化学试剂均为分析纯。

　　 1.2 色谱条件

     流动相由0.1mol・L-1 乙酸钠、0.1mol・L-1 柠檬酸（pH4.1）、0.03mmol・L -1 Na 2 EDTA和25%乙腈组成，其在使用前需经过滤器处理和超声装置除气。泵流速为1ml・min -1 。电化学检测器电位设定为0.95V，响应设定为中档，量程为2nA，工作电极为玻碳电极，比较电极为Ag.AgCl。

　　1.3 标准品制备准确称取MT标准品，用流动相配制一系列标准溶液，浓度分别为0.086、0.129、0.172、0.344、0.430、0.860和1.72nmol・L-1 ，分别取上述标准溶液加入到2ml的空白液中，按样本处理方法处理，取90μl溶液进行分析，制作标准工作曲线。

　　 1.4 样品制备

     卧位，肘前静脉采血，血清贮存在-43℃冰箱中待分析。取2ml血清放入50ml带盖玻璃管中，加入12ml氯仿、0.2ml0.1mol・L-1 NaOH溶液，混合液在水平振荡器上振荡15min，离心（6000r・min -1 ，15min，4℃）。取出11ml氯仿层转移到另一20ml玻璃管中，用4ml去离子水冲洗3次再离心。取出10ml氯仿层到另一20ml玻璃管中，放入真空干燥器中干燥。在室温下残留物用0.5ml氯仿溶解，然后用N 2 吹干，反复3次。最后残留物用100μl流动相溶解，取90μl溶液进样分析。

     1.5 数据统计处理

     计算均值、标准差。

　　 2 结  果

　　2.1 色谱结果

     在上述色谱条件下，样本中的MT保留时间为15.68min，能与其它峰有效地分开（图1、2）。

     2.2 检测限和线性范围当以信噪比（S.N）=3为最低检测限时，本方法测定血清MT的最低浓度为0.084nmol・L -1 。制作标准工作曲线，结果表明，MT浓度在0.086～1.720nmol・L -1 范围内有良好的线性结果，r=0.9989

     2.3 精密度

     取3份不同的血清样本分别测定日内和日间重复性，结果表明本方法的日内变异为4.2%～4.8%，日 间变异为4.4%～5.0%（表1）。 表1  HPLC法测定血清褪黑激素精密度试验 样品 日内实验
   2.4 回收率

     在同一份样本中分别加入不同量的MT进行测定，结果表明本方法的回收率为55.3%～76.5%（表2）。  表2  HPLC法测定血清褪黑激素回收率
    
　　3 讨  论

     MT水平在精神和内分泌等异常时的改变已经引起临床方面的兴趣，为了临床研究的需要，提供可靠的检测MT水平方法十分必要。大多数研究者通常采用放射免疫法或气.质联用法检测血清.血浆MT含量，1980年Goldman等［11］ 首次用HPLC电化学法进行MT检测，但由于该方法最低检测浓度为50pg（0.22nmol）［S.N=3］而无法检测血清.血浆MT含量。本实验采用HPLC电化学法检测MT含量，该方法的最低检测浓度为0.084nmol・L -1 ，能满足临床研究的要求。

    本实验方法中没有采用固相萃取法而采用液相萃取法提纯样品，这样可使操作步骤简化。萃取时如用国产三氯甲烷需经重新蒸馏后才能使用，否则其中杂质干扰MT的色谱峰。在制作标准工作曲线时，空白液是在血清中加入活性碳然后过滤所得，以去除内源性MT。用本实验方法测定血清MT含量和国外文献报道基本相符。该方法已被初步用于临床研究松果体 素改善糖尿病患者的应激状态。

　　 ［参考文献］

    ［1］CHEGINI S，EHRHART B，KAIDER A，et al.Direct enzyme-linked immune-sorbent assay and a radioimmunoassay for melatonin compared［J］.Clin Chem，1995，41（3）:381.386.

    ［2］CONTI A，MAESTRONI G J.Role of the pineal gland and melato-nin in the development of autoimmune diabetes in non-obese dia-betic mice［J］.J Pineal Res，1996，20（3）:164.172.

    ［3］PIERREFICHE G，TOPALL G，COURBOIN G，et al.Antioxidant activity of melatonin in mice［J］.Res Commun Chem Pathol Phar- macol，1993，80（2）:211.223.

    ［4］DI W L，KADVA A，DJAHANBAKHCH O，et al.Radioimmuno-assay of bound and free melatonin in plasma［J］.Clin Chem，1998，44（2）:304.310.

    ［5］ YIE S M，JOHANSSON E，BROWN G M.Competitive solid-phase enzyme immunoassay for melatonin in human and rat serum and rat pineal gland［J］.Clin Chem，1993，39（11）:2322.2325.

    ［6］BEST S A，MIDGLEY J M，HUANG W，et al.The determination of5-hydroxytryptamine acid in the bovine eye by gas chromatogra-phy-negative ion chemical ionization mass spectrometry［J］.J  Pharm Biomed Anal，1993，11（4.5）:323.333.

    ［7］SIMONIN G，BRU L，LELIVRE E，et al.Determination of me-latonin in biological fluids in the prescence of the methods［J］.J Pharm Biomed Anal，1999，21（3）:591.601.

    ［8］ROMSING S，ULFBERG J，BERGQVISTY.Determination of me-latonin in human plasma with solid-phase extraction，high-perfor-mance liquid chromatography and fluorescence detection［J］.Scand J Clin Lab Invest，2003，63（1）:81.88.

    ［9］RIZZO V，PORTA C，MORONI M，et al.Determination of free and total melatonin in plasma and cerebrospinal fluid by high-per-formance liquid chromatography with fluorescence detection［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2002，774（1）:17.24.

    ［10］IINUMA F，HAMASE K，MATSUBAYASHI S，et al.Sensitive determination of melatonin by precolumn derivatization and re-versed-phrase high-performance liquid chromatography［J］.J Chro- matogr A，1999，835（1.2）:67.72.

    ［11］GOLDMAN M E，HAMM H，ERICKSON C K.Determination of melatonin by high-performance liquid chromatography with electro-chemical detection［J］.J Chromatogr，1980，190（1）:217.220.