Literature
Home药品天地专业药学实验技术色谱技术色谱论文

基于二维液相色谱系统ProteomeLabTM PF 2D的维吾尔族宫颈癌患者血清蛋白质组谱分析

来源:中国论文下载中心
摘要:【摘要】目的利用高效二维液相色谱分离系统(ProteomeLabTMPF2D)建立维吾尔族妇女宫颈癌患者血清蛋白质组表达谱。方法制备患者血清样品,通过一维色谱聚焦(等电聚焦)对样品进行分离,以每0。0范围收集44个组分,经二维反相层析分离以上组分后,利用ProteoVue软件对所有数据进行系统分析,产生以pI/UV比值为单位的......

点击显示 收起

【摘要】  目的  利用高效二维液相色谱分离系统(ProteomeLabTM PF 2D)建立维吾尔族妇女宫颈癌患者血清蛋白质组表达谱。方法  制备患者血清样品,通过一维色谱聚焦(等电聚焦)对样品进行分离,以每0.3pH单位为一个区段在pH值 8.5~4.0范围收集44个组分,经二维反相层析分离以上组分后,利用ProteoVue 软件对所有数据进行系统分析,产生以pI/UV比值为单位的色谱图。结果  对血清样品通过高效二维液相色谱分离系统(ProteomeLabTM PF 2D)分析,共观察到54个蛋白质峰,能够根据蛋白的等电点和疏水性成功建立维吾尔族妇女宫颈癌患者特异的血清蛋白质组表达谱。结论  高效二维液相色谱分离系统(ProteomeLabTM PF 2D)是建立血清蛋白质组表达谱的有效方法,可以为肿瘤患者血清蛋白质组差异表达谱研究及筛选肿瘤生物标志物提供依据。
【关键词】  高效二维液相色谱 维吾尔族妇女宫颈癌 血清蛋白质组
    【Abstract】  Objective  To establish serum proteome profile of cervical cancer in Uighur women by high performance two dimensional liquid phase chromatography system ProteomeLabTM PF 2D. Methods  The serum sample was prepared and separated by first dimensional chromatofocusing (isoelectric focusing). 44 fractions in ranges of pH8.5-4.0 were collected by setting up 0.3 pH units as one section. After second dimensional fractionation by reverse phase chromatography and analyzing the whole data by ProteoVue software, a chromatogram map with the pI/UV value was generated.Results  After analysis of serum samples by high-performance two dimensional liquid phase chromatography, 54 protein peaks were observed and serum proteome profile of cervical cancer in Uighur women were established. Conclusion  High performance two dimensional liquid phase chromatography system ProteomeLabTM PF-2D is an effective method to establish serum proteome expression profile and to provide the evidence for studying the differential expression profile of serum proteome of cancer patients and screening tumor biomarker.
【Key words】  two dimensional liquid phase chromatography; cervical cancer in Uighur women; serum proteome profile
    近年来,液相分离技术如高效液相色谱和毛细管电泳已逐渐成为血清蛋白质和多肽分离分析的新手段。在血清蛋白组的研究中,液相分离技术与二维凝胶相比,蛋白质不经过变性等前处理,可检出在前处理中可能丢失的蛋白,同时能解决低丰度、低含量蛋白质和疏水性难溶性膜蛋白的分离分析,易获得完整蛋白质且直接用于质谱分析,获得全蛋白质图谱信息。因此,作为和二维凝胶电泳互补的一种分离模式迅速发展,已成为生物大分子快速分离鉴定的有力工具[1]。本研究所基于的ProteomeLabTM PF 2D系统主要采用两种高分辨率的分离模式的联合,以等电聚焦作为样品的预分离模式,通过在线的方式二维反相色谱分离进行耦联,从而实现对复杂血清样品的分离,从而建立新疆维吾尔族妇女宫颈癌患者血清蛋白质组表达谱。
  1  材料与方法
    1.1  仪器和试剂  二维液相色谱仪: ProteomeLabTM PF-2D目标蛋白快速分离系统和配套试剂盒为Beckman Coulter公司产品,试剂盒中包括HPCF(high performance chromato focusing) 1D色谱聚焦分离柱(2.1mm×250mm)、HPRP(high performanc reversed phase) 2D无孔硅胶C18反相色谱柱(4.6mm×33mm)、起始缓冲液(SB,start buffer,pH 8.5±0.1)、洗脱缓冲液(EB,elution buffer, 4.0±0.1)和PD10-25脱盐柱(SephadexTM G-25, Amersham Pharmacia Biotech)。纯水、乙腈、三氟乙酸(TFA)、亚氨基二乙酸、甲醇等购于MERCK公司,为色谱纯。BCA Protein Assay Kit(Novagen)。
    1.2  标本收集  采集维吾尔族妇女子宫颈癌患者(未进行任何治疗)抗凝血液2~3ml,高速离心提取血清,经PD10-25脱盐柱脱盐纯化处理,用2ml SB缓冲液溶解稀释后BCA法测定蛋白质浓度。
    1.3  一维色谱聚焦分析
    1.3.1  色谱条件  HPCF 1D色谱柱,流动相为SB、EB(用50mg/ml的饱和亚氨基二乙酸溶液或1M的NH4OH分别调节pH为8.5±0.1和4.0±0.1);1 M NaCl和水。试验前将各溶液脱气5min,设定流速为0.2ml/min,检测波长为280nm,室温运行。系统pH计在线监测流动相的pH,每次运行前用pH标准液(pH 4.0、7.0、10.01)依次校正该系统pH计。
    1.3.2  分析程序  整个程序运行由32 Karat软件(二维液相色谱仪自带)控制自动进行,先以30 CV(柱体积)的SB平衡柱子(约运行130min),然后将蛋白样品4mg进样,用SB洗脱20min,再用EB洗脱55min,pH值开始下降时,每间隔0.3个pH单元收集1份样品。当流出液的pH为4.0±0.1时,用10倍柱体积的1mol/L NaCl和水依次洗脱。收集的样品可立即进行试验或保存于-80℃的冰箱内待用。
    1.4  二维反相色谱分析
    1.4.1  色谱条件  HPRP 2D色谱柱,流动相A为0.10%TFA水溶液,流动相B为0.08% TFA乙腈溶液,试验前脱气5min,设定流速为0.75ml/min,检测波长为214nm,50℃恒温运行。
    1.4.2  分析程序  用10 CV的流动相A平衡柱子,然后对一维分离后收集的样品按线性洗脱梯度进行洗脱,洗脱梯度为0~100%B,30min。ProteoVue软件(ProteomeLab PF 2D自带)自动保存每份样品的色谱数据并可将其转换成模拟pI/UV胶图。
    1.5  数据分析比较  DeltaVue软件可将正常和维族妇女宫颈癌患者血清蛋白质组的模拟pI/UV胶图数据进行比较,并可将差异峰以条带的直观图像形式进行显示。
  2  结果
  维族妇女宫颈癌患者血清样本进行一维色谱聚焦分离(见图1),pH值由8.5降至4.0,每间隔0.3个pH单元收集1份样品,在pH值8.5~4.0之间共收集44个组分,在140min时出现强吸收峰。然后将一维分离的pH值8.5~4.0之间的样品分别进行二维分析,得到的每个样品的二维UV图谱经ProteoVue软件转换成胶图,每个峰对应一条带,条带的颜色和深浅代表峰面积的大小,转换成的胶图更利于观察。图2为宫颈癌患者血清的44个组分的pI /UV图,共计54个蛋白条带,横坐标为各个组分,纵坐标为UV检测吸收峰值。
    3  讨论
  子宫颈癌是全球妇女中发病率仅次于乳腺癌而占第二位的恶性肿瘤,子宫颈癌每年夺取近27万妇女的生命,占妇女癌症死亡率的9%,成为严重威胁妇女健康的恶性肿瘤[2~4]。南疆维吾尔族妇女宫颈癌的患病率(590/10万)是我国妇女平均患病率(138/10万)的4倍,被列为新疆特高发疾病之一[5,6]。基因的功能主要是通过其表达的蛋白质来实现的,而蛋白质表达的时空性、表达量的动态变化、翻译后加工和修饰等的情况,是基因组学研究不能解决的问题,必须在蛋白质组学的研究中找到答案。二维液相色谱仪与质谱仪串联运用而发展起来的液/质联用蛋白质组学分析技术已广泛应用于药物组分检测、临床医学检验以及肿瘤的蛋白质组学研究等领域中,为寻找肿瘤生物标志物开辟了新的途径[7~10]。Lin等人应用蛋白质双向电泳和离子阱喷雾质谱技术对台湾妇女子宫原位癌、鳞癌患者组及正常对照组血浆进行蛋白质组学筛查分析,发现其蛋白质组织文图谱中6个峰值有明显差异,可以以91%或97%的灵敏度对原位癌和鳞癌分型[11]。Rai 等人应用蛋白质组学的方法对卵巢肿瘤患者术前的血清进行差异蛋白筛选,发现4种标志蛋白,并证明联用4个标志物其敏感性高达94%[12]。我们通过对血清样品通过高效二维液相色谱分离系统(ProteomeLabTM PF 2D)分析,成功建立维吾尔族妇女宫颈癌患者特异的血清蛋白质组表达谱,进一步证明该系统是建立血清蛋白质组表达谱的有效方法,可以为肿瘤患者血清蛋白质组差异表达谱研究及筛选肿瘤生物标志物提供依据。
【参考文献】
1  Dai J, Zhang Y, Wang J, et al. Identification of degradation products formed during performic oxidation of peptidca and proteins by high-performance liquid chromatography with matrix-assisted laser desorption/ionization and tandem mass spectrometry.Kapid Commura Mass Spectrum,2005,19(9):1130-1138.
2  Ferlay J, Bray F, Pisani P,et al. GLOBOCAN 2002; Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide IARC Cancer Base,2004,No.5, version 2.0, IARC Press, Lyon.
3  Yang BH, Bray FI, Parkin DM, et al. Cervical cancer as a priority for prevention in different world regions: an evaluation using years of life lost. Int J Cancer,2004,109(3):418-424.
4  Cohen J. High hopes and dilemmas for a cervical cancer vaccine. Science,2005,308:618-621.
5  拉莱·苏祖克, 彭玉华,周康,等.新疆不同民族子宫颈癌发病趋势分析.新疆医科大学学报,2006,29(7):569-571.
6  古扎丽努尔,彭芝兰,郭英.HPV及其亚型在四川西北地区汉族及新疆南部地区维吾尔族妇女宫颈癌组织中的差异表达.中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(5):406.
7  Wittke S, Mischak H, Walden M,et al.Discovery of biomarkers in human urine and cerebrospinal fluid by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry: towards new diagnostic and therapeutic approaches. Electrophoresis,2005,26(7-8):1476-1487.
8  Skalnikova H, Halada P, Dzubak P,et al.Protein fingerprints of anti-cancer effects of cyclin-dependent kinase inhibition: identification of candidate biomarkers using 2-D liquid phase separation coupled to mass spectrometry. Technol Cancer Res Treat,2005,4(4):447-454.
9  Li H, Desouza LV, Ghanny S,et al.Identification of candidate biomarker proteins released by human endometrial and cervical cancer cells using two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry.J Proteome Res,2007,5:25.
10  Haixing Wang, Maureen T. Kachman, Donald R.Schwartz, et al.Comprehensive proteome analysis of ovarian cancers using liquid phase separation, mass mapping and tandem mass spectrometry: A strategy for identification of candidate cancer biomarkers. Proteomics,2005,4(8):2476-2495.
11  Lin YW, Lai HC, Lin CY, et al. Plasma proteomic profiling for detecting and differentiating in situ and invasive carcinomas of the uterine cervix. Int J Gynecol Cancer,2006,16(3):1216-1224.
12  Rai AJ, Zhang Z, Rosenzweig J,et al.Proteomic approaches to tumor marker discovery. Arch Pathol Lab Med,2002,126:1518-1526.
作者: 未知 2009-1-23
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具