液相色谱串联质谱法测定兔血浆中葛根素的浓度

【摘要】  目的 建立测定兔血浆中葛根素浓度的液相色谱串联质谱法。方法 血浆加入内标橙皮苷后经固相萃取处理，采用Aglient C18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）分离，流动相为甲醇10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液乙腈（体积比70∶20∶10），流速为0.2 mL·min-1。样品在串联质谱中经ESI源离子化后以多反应离子监测方式测定。结果 葛根素在10~3 000 ng·mL-1线性良好(r=0.9986)，检测限为10 ng·mL-1，回收率为99.91%~103.92%，绝对回收率为91.33%~100.40%，日内、日间变异（RSD）均≤15%，色谱峰保留时间为1.67 min。结论 方法灵敏、准确、快速、特异性强，适用于中药葛根素的药动学研究。

【关键词】  液相色谱质谱法；葛根素；血药浓度

　　葛根素（puerarin）是中药葛根的主要成分之一，具有扩张冠脉血管、降低血压和心肌耗氧量、抗心律失常等作用［1］。文献报道的葛根素血药浓度测定方法多数是高效液相色谱法［2-4］，但有时也难以满足药动学研究中微量血药浓度的测定要求，且分析用时较长。本文建立测定葛根素血药浓度的液相色谱串联质谱（LCMSMS）法，具有简便、灵敏度高、特异性强且检测快速等优点，适用于葛根素的药动学研究。

　　1  材料与方法

　　1.1   仪器与试药 美国AB公司API3000型液质联用系统；Waters 20管型固相萃取仪；TECHNE样品浓缩仪；Waters HLB固相萃取小柱(100 mg)。葛根素注射剂（浙江康恩贝制药股份有限公司，0.25 g/5mL）；葛根素、橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为：0752200108，0721200104）；甲醇、乙腈为色谱纯；醋酸胺为分析纯；重蒸馏水。

　　1.2  色谱及质谱条件色谱柱：Aglient C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），流动相：甲醇10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液乙腈（体积比70∶20∶10），流速为0.2 mL·min-1。辅助气化电喷雾离子源（ESI），多反应离子监测（MRM）模式正离子检测，检测离子对：m/z 417.2→267.2（葛根素），m/z 611.2→303.2（内标橙皮苷），辅助气化气流量：7500 CC·min-1，雾化气流量：8 L·min-1，气帘气流量：8 L·min-1，碰撞气流量：6 L·min-1，离子源喷雾电压：5 500 V，离子源雾化温度：350 ℃。

　　1.3  对照品及内标溶液的配制  精密称取适量的葛根素对照品，用甲醇溶解并定容得160 μg·mL-1的对照品溶液；精密称取适量的橙皮苷对照品，用甲醇溶解并定容得500 ng·mL-1的内标溶液。

　　1.4  血浆样品处理  固相萃取小柱用1.0 mL甲醇活化和1.0 mL双蒸水平衡，取血样300 μL加入10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液300 μL和内标溶液20 μL，混匀后上样，双蒸水1.0 mL洗涤，0.5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于45 ℃水浴下用N2吹干浓缩，加入150 μL流动相复溶，取5 μL进样。

　　2  结果

　　2.1  方法专属性  根据葛根素和内标物橙皮苷的子离子质谱扫描结果（见图1），分别选择特异的m/z 417.2→267.2和m/z 611.2→303.2用于定量监测。按照血浆样品处理方法和检测条件，空白血浆的色谱图、空白血浆加葛根素和内标对照品的色谱图、用药后血浆色谱图，分别见图2A、图2B和图2C。结果表明，葛根素和内标物的保留时间分别为1.67 min和1.75 min，血浆中无内源性物质和基质效应干扰，方法特异性强。

　　图1  葛根素（1）和橙皮苷（2）的质谱子离子扫描图（略）

　　Fig.1  Full scan MS-MS spectra of puerarin (1) and hesperidin (2)

　　A.空白血浆; B.空白血浆加入葛根素和橙皮苷对照品; C.兔给药后血浆

　　1.葛根素m/z 417.2→267.2, tR=1.67 min;  2.橙皮苷 m/z 611.2→303.2, tR=1.75 min

　　图2  血浆中葛根素和橙皮苷的色谱图（略）

　　Fig.2   Chromatograms of puerarin and hesperidin in plasma by LCMSMS

　　2.2  标准曲线及线性范围  取空白血浆加入葛根素对照品溶液，配制成浓度为10、30、100、300、1 000、3 000 ng·mL-1的血浆标准曲线样品，按“1.4”项下方法操作，计算葛根素与内标峰面积比，得回归方程为：Y=0.002 99C+0002 34，r=0.998 6，权重1/X2。血浆中葛根素在10~3 000 ng·mL-1范围内与峰面积比线性关系良好，定量下限为10 ng·mL-1。
2.3  精密度与相对回收率　　取空白血浆加入葛根素对照品溶液，制备浓度为10、1 500和2 500 ng·mL-1的血浆质控样品，按“1.4”项下方法操作测定，每个浓度的样品在1d内作5份样品分析，连续测定3 d，计算方法的日内和日间差，结果低、中、高3种浓度的日内RSD分别为7.56%，4.43%，9.66% (n=5)；日间RSD分别为13.58%，7.20%，7.06%(n=15)；将实测值与真实值相比得相对回收率，结果低、中、高3种浓度的相对回收率分别为（103.92±14.12）%，（99.91±719）%，（100.29±7.08）% (n=15)。

　　2.4   提取回收率　　取空白血浆样品按“1.4”项下提取、吹干，然后加入分别含10、1 500和2 500 ng·mL-1葛根素对照品的流动相150 μL复溶(n=5)，使对照品溶液含空白血浆基质，测定其峰面积并计算得均值A1，A2，A3；另取低、中、高浓度的质控血浆各5份，按“1.4”项下方法操作、测定峰面积，分别与A1，A2，A3进行比较，计算本法的提取回收率(n=5)，分别为（91.33±11.06）%，（100.40±7.97）%，（96.36±6.28）%。

　　2.5  稀释能力试验取浓度为2 500 ng·mL-1的血浆质控样品5份，用空白血浆稀释5倍后按“1.4”项下方法操作，将测定值乘稀释因子后与标示值比较，准确度为（98.45±3.57）%。所以对高于定量上限的样品可用空白血浆稀释后测定。

　　2.6  稳定性试验　　取低、中、高3种浓度的血浆质控样品各5份，分别在-75 ℃保存5个月、室温21 ℃放置24 h及经3个冷冻融解循环处置，然后按“1.4”项下方法操作，测定值与真实值比较，相对偏差均<15%，表明血浆样品稳定；血样制备后的待测液在自动进样器中放置6 h，其测定值与真实值比较，相对偏差均<15%，表明待测液在测定过程中也是稳定的。

　　2.7  兔体内血药浓度的测定取新西兰兔6只（广州中医药大学动物实验中心提供），雌雄兼有，体重2.0~2.5 kg，禁食12 h后于耳缘静脉注射葛根素100 mg，于注射前、注射结束后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h取耳缘静脉血2 mL，置肝素抗凝管中，离心(3 500 r/min)15 min，吸取上层血浆进行分析，以标准曲线计算各时间点样本中的葛根素浓度，同时测定质控样本以保证结果的可靠性。兔静脉注射葛根素后的平均药时曲线见图3。

　　3  讨论　　

　　葛根素选择m/z 417.2→267.2作为监测离子对，特异性强且具有较高的仪器响应值。以含醋酸铵缓冲液的甲醇乙腈作为流动相，可使灵敏度进一步提高和有利于检测体系稳定。使用SPE法净化血浆样品，能有效消除LCMSMS法检测生物样品时常有的基质效应的影响，而且使用Waters HLB小柱，提取效率很高，本试验曾对提取步骤中的洗涤液和二次甲醇洗脱液进行跟踪检测，均无葛根素的检出。药动学研究涉及一系列的血样采集、保存、制备和测定等步骤，药物在纷繁的操作过程中是否保持稳定，需预先在方法学确证试验中进行考察，稳定性试验结果表明，在上述条件下血样中的葛根素是稳定的。LC/MS/MS技术已开始在中药药动学研究得到应用，其特异性强、灵敏度高等优点可满足在复杂的生物样品中进行微量成分分析的要求。本试验采用此技术测定中药葛根素的血药浓度，定量下限达到10 ng·mL-1，目标物和内标物的保留时间均在2 min之内，检测快速。本方法的各项指标符合生物样品定量分析方法学的要求，可用于药动学研究的大量血样的测定。

　　图3  兔静脉注射葛根素100 mg后的平均血药浓度时间曲线（n=6）（略）

　　Fig.3  The concentrationtime curve of puerarin in rabbit plasma after iv 100mg（n=6）

【参考文献】
  　［1］ 朱庆嘉，吕欣然.葛根素的药理学和临床应用研究进展［J］.中草药,1997,28(11):693.
　　［2］ 潘远江，王骊丽，黄敬群，等.三维HPLC法同步测定犬血浆中的葛根素及阿魏酸［J］.沈阳药科大学学报，2001，18（1）：45-49.
　　［3］ 张志荣，游学均，何勤，等.HPLC测定血浆中葛根素［J］.中国药学杂志，1997，32（2）：104-106.
　　［4］ 金昔陆，朱秀媛，王文杰，等.血浆中葛根素的高效液相色谱测定法及其在狗体内的药代动力学［J］.药学学报，1997，32（10）：782-785.