固相萃取差示脉冲伏安法测定牛黄解毒片的黄芩苷

　　【摘要】  目的研究黄芩苷在玻碳电极上的伏安行为,建立牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定方法。方法Waters PlusC18(1 mL/50 mg,30 μm)固相萃取柱进行样品前处理,采用循环伏安法与差示脉冲伏安法研究黄芩苷在玻碳电极上的伏安行为。结果用20%甲醇1.0 mL能完全洗脱黄芩苷;在pH 3.0磷酸盐缓冲溶液中,黄芩苷的差示脉冲伏安峰电流与其浓度在1×10-6~9×10-5 mol/L呈良好的线性关系,检测限为1×10-7mol/L。结论本法简便、经济,灵敏度高,用于牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定效果满意。

　　【关键词】  电化学 色谱法 固相萃取 牛黄解毒丸 黄芩苷

　　牛黄解毒片为常见清热解毒中药制剂,其处方由牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片和甘草8味中药组成。方中黄芩泻火解毒,黄芩苷为其主要有效成分之一。因此,中国药典(2005版)采用高效液相色谱法[1]分析牛黄解毒片中的黄芩苷成分以控制牛黄解毒片的质量,该法准确,但费时,所需仪器设备昂贵。已有文献报道采用紫外分光光度法、高效毛细管电泳法等方法测定方剂中黄芩苷的含量[2

　　3],但样品前处理大多涉及到溶剂多次萃取过程,操作较复杂且准确度和精密度不好。考虑到黄芩苷分子中的酚羟基结构具有电化学活性,可利用电化学分析手段对其进行微量和特异性的检测。笔者研究黄芩苷在玻碳电极(GCE)上的循环伏安和差示脉冲伏安行为,建立其差示脉冲伏安测定法。

　　1 材料和方法

　　1.1仪器电化学分析仪(CHI660B，上海辰华仪器公司);精密酸度计(pHS3B型，上海雷磁仪器厂);医用数控超声波清洗器(KQ250DE型，昆山市超声仪器有限公司);Waters PlusC18固相萃取小柱(1 mL/50 mg,30 μm),柱材料为十八烷基键合硅胶(美国Waters公司)。

　　1.2试剂无水乙醇、甲醇及磷酸(AR,安徽安特生物化学有限公司);牛黄解毒片(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,规格片心重0.27 g,批号:4122356,6121877,6120617);1×10-3mol/L黄芩苷标准溶液:准确称取黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所)5 mg,用70%乙醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶,避光保存;磷酸盐缓冲液(PBS)由0.05 mol/L NaH2PO4Na2HPO4+0.02 mol/L NaCl配制,并用H3PO4与0.1 mol/L NaOH调节至所需pH值;所用试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

　　1.3方法

　　1.3.1电极预处理以饱和甘汞电极为参比电极(以下所述电位均相对于该电极),铂丝电极为对电极,玻碳电极(GCE)为工作电极。玻碳电极依次用金相砂纸和0.05 μm氧化铝粉末和水的混合物抛光至镜面,然后依次用1∶1乙醇和二蒸水超声清洗,取出后待用;实验前,测定系统用2 mmol/L K3Fe(CN)6水溶液校准,电位测量误差为±0.004 V,全部实验在室温下进行。

　　1.3.2黄芩苷循环伏安行为采用三电极系统,以饱和甘汞电极为参比电极(以下所述电位均相对于该电极),铂丝电极为对电极,以GCE为工作电极,在-0.2~-0.8 V电位研究黄芩苷的循环伏安行为,并考察扫描速度、溶液pH等因素对黄芩苷电化学氧化的影响。

　　1.3.3差示脉冲伏安法测定黄芩苷用 0.05 mol/L PBS作为媒介溶液,在-0.2~-0.8 V电位测定黄芩苷的差示脉冲伏安曲线,记录氧化峰电流值,并用空白溶液进行背景校正。

　　1.3.4固相萃取分离纯化样品将牛黄解毒片20片原药除去外壳黄色包衣后研成粉末。准确称取试样0.6 g于锥形瓶中,加70%乙醇30 mL,超声处理20 min,放冷,滤过,滤液置100 mL量瓶中,用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣,洗液滤入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,摇匀,待用。用甲醇1 mL活化SPE柱后,再用二蒸水0.5 mL平衡固定相,速度为每秒1滴。将上述处理好的试样加到SPE柱上,每次上样200 μL,再用二蒸水200 μL作为洗脱溶剂洗脱,用注射器尽量吹出SPE柱中的洗脱溶剂,最后用25%甲醇1 mL将黄芩苷洗脱,收集洗脱液约1.0 mL。

　　1.3.5固相萃取洗脱条件选择与萃取回收率以高、中、低3个浓度(1×10-5,3×10-5,5×10-5 mol/L)的黄芩苷标准溶液为研究对象,均于固相萃取柱上上样200 μL,分别使用0.5%,10%,25%,40%,60%,80%,100%甲醇水溶液各1 mL进行洗脱。记录黄芩苷色谱带完全流出所需的时间和体积,采用高效液相色谱法测定黄芩苷含量并计算其回收率[8],以萃取回收率作为评价指标。

　　2 结果

　　2.1黄芩苷在玻碳电极上的循环伏安行为在pH 3.0 PBS溶液中,以2.0×10-5 mol/L黄芩苷为分析对象,其在玻碳电极上的氧化峰电位(Epa)为0.420 V,还原峰电位(Epc)为0.395 V,两峰电位相差25 mV(图1)。改变溶液pH值,记录黄芩苷在不同pH值中的循环伏安图(图2),计算各pH溶液中的式量电位E°′值,将其对溶液的pH值作图(图3),可得一直线,其斜率为-64.7 mV/pH,此外,在pH 3.0 PBS溶液中,随着扫描速度从20 mV/s增加到140 mV/s,其氧化峰电流(Ip)明显增大,且Ip与扫描速度(v)呈良好的线性关系。

　　A:黄芩苷; B:空白溶液.扫描速率:100 mV/s.

　　2.2电化学检测体系工作条件的选择影响伏安法测定灵敏度和分辨率的主要因素一般有伏安法的类型、酸度,扫描电位等因素。以黄芩苷的氧化峰为测定对象,优化选择测定实验条件。

　　2.2.1方法应用循环伏安法(CV),线性扫描伏安法(LSV),方波伏安法(SWV)和差示脉冲伏安法(DPV)等对黄芩苷的PBS(pH 3.0)溶液在玻碳电极(GCE)上的电化学进行比较。在相同的测定条件下,DPV的测定灵敏度相对较高,因此,选用DPV法作为测定方法对黄芩苷在玻碳电极上的电化学行为进行研究。

　　2.2.2底液pH值与起扫电位缓冲溶液的pH值对黄芩苷的氧化峰电流的影响(图5),当溶液pH为3.0时黄芩苷的氧化峰电流最大,因此实验中选择pH 3.0 PBS为底液。随后,随着pH增大,峰电流逐渐变小,进一步说明黄芩苷的电极反应涉及到了质子的转移。

　　选用不同的起扫电位,按实验方法在相同条件下测定循环伏安曲线。黄芩苷氧化峰电流随起扫电

　　图5pH与峰电流的关系

　　Fig 5The relationship of peak current (Ip) and pH

　　位的负移而减小,表明在测定条件下,起扫电位越负越不利于黄芩苷在电极表面的氧化。在实际样品分析中,为避免大黄素峰与黄芩苷峰重叠产生干扰,实验中选择起扫电位为-0.4 V,此时大黄素和黄芩苷的式量电势分别为-0.2 V和0.4 V。

　　2.3标准曲线绘制以DPV分别测定不同浓度的黄芩苷标准溶液的峰电流(Ip) (图6),在1×10-6~9×10-5 mol/L,黄芩苷的Ip与其浓度C呈良好的线性关系,线性回归方程为:

　　Ip(μA)= 0.0342C(μmol/L)+0.3576

　　相关系数r =0.9991,检出限为1×10-7mol/L(S/N=3)。

　　a:1;b:5;c:10;d:20;e:30;f:40;g:50;h:60;i:70;j:80;k:90 μmol/L

　　图6黄芩苷标准溶液的峰电流与浓度的关系

　　Fig 6The relationship of baicalin standard solution and peak current (Ip)

　　2.4固相萃取(SPE)洗脱条件和萃取回收率按1.3.5方法处理用25%甲醇水溶液为流动相洗脱,效果最佳,计算平均回收率分别为99.7%。因此,实验中用25%甲醇1.0 mL淋洗并收集洗脱液。

　　2.5干扰试验考虑到实际样品分析溶液中还共存有大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸等蒽醌类物质，因此在电化学测定过程中,以5×10-6mol/L黄芩苷(pH 3.0)为测试对象,分别考察大黄素(1×10-4mol/L)、大黄酚(1×10-4mol/L)、大黄素甲醚(1×10-4mol/L)和大黄酸(1×10-4mol/L)对黄芩苷DPV响应信号的影响。上述蒽醌类物质均在-0.2 V左右出峰,对式量电势约0.4 V的黄芩苷氧化还原峰无干扰,此外考察洗脱溶剂甲醇的影响,1 000倍量的甲醇对黄芩苷的电化学信号无影响。

　　2.6精密度和稳定性试验1×10-6mol/L黄芩苷标准溶液平行测定5次,结果的相对标准偏差(RSD)为2.6%,表明精密度良好。对1×10-6mol/L黄芩苷标准溶液于1,2,3,4,5,6,7,8 h进行分析,计算得RSD为3.1%。

　　2.7回收率及样品含量测定取已知黄芩苷含量(2.667 mg/g)的牛黄解毒片粉末0.6 g,精密称定,共5份,各加入黄芩苷标准品1 mg,按1.3.4方法处理,收集25%甲醇洗脱液,各用水稀释为10 mL。以DPV测得牛黄解毒片中黄芩苷的加样平均回收率为95.6%。

　　取3批样品,按所建立的方法测定黄芩苷含量,采用药典方法[1]进行对比,结果见表1。表1样品含量测定结果

　　3 讨论

　　3.1电极过程机制由可逆电极反应的判断依据:⊿Ep=Epa-Epc=59/n(mV),实验测得黄芩苷在玻碳电极上的⊿Ep = 25 mV,可以推算出n=2.3,即电子转移数n约为2,该结果与黄芩苷分子结构中的2个酚羟基电活性基团相符;在pH 2.0~8.0,黄芩苷峰电位与pH呈良好的线性关系,对可逆氧化还原反应dE/dpH=-59x/n,实验中黄芩苷的dE/dpH=-64.7,故可得出x/n=1,其中n=2,所以x=2,即质子转移数为2。此外,在pH 3.0 PBS溶液中,随着扫描速度从20 mV/s增加到140 mV/s,其氧化峰电流(Ip)明显增大,且Ip与扫描速度(v)呈良好的线性关系(图4),说明黄芩苷在玻碳电极上的氧化反应为吸附控制步骤。而黄芩苷的Epa与Epc不随扫描速度的变化而发生改变,表明黄芩苷在电极表面吸附后发生了可逆反应。由此可推断黄芩苷在玻碳电极上的氧化还原反应是一个两电子两质子的可逆过程,其电催化氧化反应可表示为:

　　3.2固相萃取条件选择因牛黄解毒片中成分较多,且含有大量辅料,测定黄芩苷必须提纯富集到足够浓度,才能达到仪器检测的灵敏度。为了进一步净化,笔者采用固相萃取作为提纯富集的步骤，实验发现采用固相萃取柱处理样品,除杂质效果好,分析物有较高回收率和重现性。

　　【参考文献】

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