邻苯二甲醛衍生荧光法测定牛奶中的苄青霉素残留

　　【摘要】  长期饮用含高浓度苄青霉素残留的牛奶可带来严重的健康问题，建立一种可对其进行灵敏检测的方法是必要的。苄青霉素在酸性条件下的水解产物之一是青霉胺，与邻苯二甲醛衍生后可生成具有强荧光的1硫代2烷基异吲哚衍生物，据此建立了荧光分光光度法测定苄青霉素的新方法。在水解时间为1 h、衍生反应体系pH为10.0、衍生试剂用量为40 μL、衍生反应时间为15 min的最佳测定条件下，线性动态范围为2.0 ～500 μg/L，检出限为1.3 μg/L，样品的平均加标回收率为89.1%，方法可满足我国对牛奶中苄青霉素残留的限量要求。

　　【关键词】  苄青霉素残留，邻苯二甲醛，衍生，荧光分光光度法

　　1  引言

　　以苄青霉素（Benzylpenicillin，PENG）、阿莫西林、氨苄青霉素为代表的β内酰胺类抗生素是历史最悠久的抗微生物药物，同时也是最大和最重要的一类抗生素，在奶牛养殖中常用于治疗奶牛的乳腺炎。尤其是苄青霉素，因其廉价并具广谱抗菌性而被大量使用。当其被频繁超剂量使用时，可导致牛奶中高浓度药物残留。长期饮用这种牛奶会使人体肠道内的正常菌群受到抑制，使致病菌、条件致病菌大量繁殖，引起全身或局部的感染。因此，许多国家对牛奶中的β内酰胺类药物尤其是苄青霉素残留进行了严格的监控。我国对牛奶中苄青霉素允许的最高限量为4 μg/L[1]。目前常用的苄青霉素检测方法有薄层色谱法[2]、电位滴定法[3]、高效液相色谱法[4, 5]及色/质联用测定法[6, 7]等，而运用荧光分光光度法测定苄青霉素残留还未见报道。

　　苄青霉素本身无荧光，在酸性加热条件下可水解产生青霉胺（penicillamine）[8]。在巯基乙醇存在条件下，邻苯二甲醛（OPA）可与青霉胺反应，形成具有强荧光的1硫代2烷基异吲哚衍生物[9]。采用常规过甲酸法使青霉胺的巯基磺酸化可有效抑制其巯基对巯基乙醇反应位点的竞争，使衍生反应更易发生。据此建立了荧光分光光度法测定牛奶中苄青霉素残留的方法。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

　　FP750型荧光分光光度计（日本JASCO公司）；pHS4型酸度计（江苏电分析仪器厂）；TG16 型离心机（长沙英泰仪器有限公司）。

　　邻苯二甲醛为Sigma 公司试剂；β巯基乙醇为Amresco公司试剂；苄青霉素购自中国药品生物制品检定所；甲酸、乙酸钠、柠檬酸、硼酸、甲醇、乙腈、Ｈ３ＰＯ４、Ｎa2SO3和Ｈ２Ｏ２均为分析纯试剂;水为去离子水，电阻率为15.0 kΩ·cm 。

　　2.2  实验方法

　　2.2.1  标准和试剂的配制  苄青霉素标准工作液的配制：精确称取苄青霉素标准品适量配成质量浓度为0.10 g/L 的储备液，置4 ℃冰箱保存。准确移取适量标准储备液，配制质量浓度为2.0～500 μg/L的苄青霉素标准工作液系列。

　　常规过甲酸溶液的配制：将V(H2O2)∶V(甲酸)=1∶9混合溶液，于室温下放置1 h，然后置冰水浴中冷却30 min，临用前配制。

　　邻苯二甲醛(OPA)衍生试剂配制：称取2.5 mg OPA溶于1 mL甲醇，加入100 μL β巯基乙醇，用甲醇定容至10 mL，置于4 ℃冰箱，可避光稳定保存３ d。

　　2.2.2  衍生反应  取适量苄青霉素标准工作液于小烧杯中，加入1 mL稀HCl (pH 2)，沸水浴1 h。然后加入100 μL常规过甲酸溶液，室温下反应30 min，加热蒸干溶剂，残渣用pH 10.0的硼酸缓冲液溶解，加入40 μL OPA衍生试剂，定容至4 mL，并于15 min 后测定，同时做试剂空白。

　　2.2.3  样品制备  准确量取1 mL 牛奶，加入5 mL酸化乙腈（pH 2.0），充分振荡，使蛋白质沉淀，离心去除蛋白质，向上清液中少量多次加入20 mL正己烷，振荡，静置，弃去上层正己烷相，以除去脂溶性物质。将下层清液减压挥干，残渣用水溶解，之后用2.2.2所述方法衍生，制得样品溶液。

　　2.2.4  仪器测定条件   荧光池1 cm×１ cm，激发和发射波长为340和455 nm，入射和出射通带宽5 nm。

　　3  结果与讨论

　　3.1  苄青霉素水解时间的选择

　　在酸催化下，苄青霉素的β内酰胺因电子转移发生分子重排。在pH 2条件下生成青霉二酸，加热时进一步水解得到青霉胺[8]。显然，水解时间将会对青霉胺的生成量产生影响。首先用固定浓度的苄青霉素溶液在pH 2.0条件下于沸水浴中分别水解20、30、40、50和60 min，然后加入100 μL常规过甲酸，磺酸化反应30 min，蒸干溶剂，用pH 10.0的硼酸缓冲液溶解残渣，再加入50 μL OPA衍生试剂，定容至4 mL，反应30 min。在选定的激发和发射波长处测定不同水解时间条件下各衍生产物的荧光强度。结果表明： 水解50 min后衍生产物的荧光强度趋于稳定，为保证水解能够进行彻底，选择水解时间为60 min。

　　3.2  常规过甲酸氧化处理对衍生反应的影响

　　青霉胺是一种含硫氨基酸，在与OPA衍生试剂反应生成异吲哚衍生物时，其巯基将会和β巯基乙醇发生竞争性反应[10]，使目标衍生产物的生成量受到影响。如果先用常规过甲酸将二硫键打开，并进一步将青霉胺中的巯基氧化成磺酸基，然后再与OPA衍生试剂反应，则可有效解决此问题。将上述水解1 h的苄青霉素溶液分别加入100 μL常规过甲酸溶液和100 μL水，其余处理方法同上。从图1结果可看出，加入常规过甲酸氧化处理的溶液与未经此处理的溶液相比，荧光强度增大了5倍。

　　3.3  pH对衍生反应的影响

　　为了解pH对衍生反应的影响，取经上述水解和过甲酸氧化处理并蒸干后的苄青霉素溶液残渣系列，分别用乙酸盐缓冲液（pH 4.0、pH 5.0）、柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.0、pH 8.0）、硼酸盐缓冲液（pH 9.0、pH 10.0）和碳酸盐缓冲液（pH 11.0、12.0）溶解，衍生反应条件同上，测定结果如图2所示。当pH<7.0时，荧光强度非常小；pH 7.0～9.0时，荧光强度增加很快；pH 9.0～12.0时荧光强度趋于稳定。产生这种结果的可能原因是，胺类在水溶液中可与水中质子作用形成其共轭酸，随着pH升高，该反应的平衡向左移动，使得共轭酸的形成被有效抑制，青霉胺以胺形态存在的量逐步增多，和OPA形成的衍生产物也就随之增多。但当pH>10.0后，背景干扰也随之增大，因此衍生反应的pH条件选择为10.0。

　　图1  未经过甲酸处理(1)和经过甲酸处理(2)的苄青霉素衍生产物的荧光发射谱图（略）

　　图2  pH值对苄青霉素衍生反应的影响（略）

　　3.4  OPA衍生试剂用量与衍生反应时间的选择

　　在上述优化的反应条件下，分别考察了不同OPA衍生试剂加入量对产率的影响。结果表明，OPA衍生试剂与苄青霉素的摩尔浓度比大于2∶1时衍生产物的产率恒定，这个摩尔比对应于OPA衍生试剂的加入量为4 μL。然而，当OPA衍生试剂在这个加入量时，衍生反应速度很慢，导致产物的荧光强度随时间递增，约50 min才能达到稳定值。随着OPA衍生试剂加入量的逐步增加，反应速度逐渐加快，荧光强度趋稳需时将越来越短，但对应的背景干扰会越来越大。综合考虑两者的影响，选择OPA衍生试剂加入量为40 μL。在此加入量下，衍生反应时间对荧光强度的影响如图3所示。当反应时间大于15 min时，荧光强度值几乎不变，所以衍生反应时间确定为15 min。此外，经检验，在室温条件下，衍生产物可在3 h内保持稳定，能够满足多样品测定的需要。

　　图3  反应时间对苄青霉素衍生产物荧光强度的影响（略）

　　3.5  线性关系与检出限

　　按优化后的最佳条件测定苄青霉素标准工作液系列，得到标准曲线方程为：F=1.01C+16.60（r=0.9995），式中F为荧光强度，C为溶液浓度，方程的线性范围为2.0 ～ 500 μg/L。

　　对空白溶液进行11次测量，与其标准偏差3倍相当的浓度为1.3 μg/L，此即为该方法的检出限，可满足我国对苄青霉素残留允许限量的要求。对50 μg/L的苄青霉素标准溶液8次平行测定值的相对标准偏差为2.６%。与已报道的方法[5]相比，线性范围均为2个数量级，但线性的浓度范围不同，本法的线性范围在低浓度区；本法检出限小于报道方法的5 μg/L。

　　3.6  共存物质的干扰

　　依本实验方法，测定50 μg/L苄青霉素溶液，在相对误差±5%范围内，衍生产物对牛奶中一些常见物质的允许浓度分别是：乳糖(46 g/L)、维生素C(０．０2 g/L)、维生素B(0.2 g/L)、Ca2+(0.37 g/L)、Mg2+(０．０75 g/L)、K+(1.34 g/L)、Fe3+(1．0 μg/L)、Cu2+（20 μg/L）。干扰实验结果表明，上述共存物质在测定条件下不会对苄青霉素的测定造成干扰。

　　表1  加标样品的回收率（略）

　　3.7  样品分析

　　对市售经超高温灭菌袋装牛奶进行了测定，未检出苄青霉素。对样品进行了3个浓度水平的加标回收率测定，结果如表1所示。平均回收率为89.1%，与已报道方法[5]的平均回收率89.3%相当。从测量数据来看，各个加标浓度的回收率基本一致，回收较完全，方法是可靠的。

　　【参考文献】

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