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柱前衍生化毛细管气相色谱法测定土壤中井冈霉素A残留

来源:中国农业大学理学院
摘要:【摘要】建立了土壤中井冈霉素A残留的柱前衍生化气相色谱分析方法。每10g土壤样品使用40mL10%氨水振荡提取60min,不需要其它净化处理。浓缩吹干后采用N,O双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)对井冈霉素A衍生化反应并进行毛细管气相色谱(FID)分析。井冈霉素A衍生物在4。...

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  【摘要】  建立了土壤中井冈霉素A残留的柱前衍生化气相色谱分析方法。每10 g土壤样品使用40 mL 10%氨水振荡提取60 min,不需要其它净化处理。浓缩吹干后采用N,O双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)对井冈霉素A衍生化反应并进行毛细管气相色谱(FID)分析。井冈霉素A衍生物在4.4~71 mg/L范围内呈良好的线性关系(r=0.9983);方法的添加回收率在94.8%~101.6%之间;相对标准偏差为1.1%~2.9%;方法的最小检出浓度为0.20 mg/kg。

  【关键词】  井冈霉素,残留分析,土壤,气相色谱,衍生化

  1  引言

  井冈霉素是吸水链霉菌井冈变种产生的水溶性农用抗生素,是1973年上海农药研究所从江西井冈山地区土壤中分离得到的,化学名称为葡萄糖井冈羟胺或N[(1S)1,4,6/53羟甲基4,5,6三羟基2环己烯基][OβD吡喃葡萄糖基(1→3)]1S(1,2,4/3,5)2,3,4三羟基5羟甲基环己胺(jinggangmycin),有A~F 6种结构。其中井冈霉素A(validamycin A)是最有活性的物质[1],主要用于防治水稻纹枯病菌,对丝核菌亦有良好生物活性,具有强内吸性,兼具保护和治疗作用,此药耐雨水冲刷,药效可持续15~20 d。目前已成为我国生产量最大的农用抗生素[2]。

  张存政等[3]对水稻叶片中井冈霉素残留量的测定。有关井冈霉素在作物和土壤中的残留分析方法鲜有报道。因为井冈霉素A是氨基糖苷类化合物,分子中含多个极性基团,难于气化,不能直接进行气相色谱分析。对井冈霉素A原药和制剂的分析多采用高效液相色谱法[4]、毛细管电泳法[5,6]、离子交换色谱法[7]、薄层荧光法[8] 及填充柱气相色谱衍生化方法 [9] 等。

  井冈霉素A在210 nm处有最大紫外吸收,目前多采用高效液相色谱带紫外检测器进行检测分析,但由于大多数物质在210 nm下均有较强的吸收,在进行液相色谱分析时受到土壤基质中的许多杂质干扰,采用多种净化方法如液液分配、固相萃取等均不能将杂质有效去除。本实验建立了井冈霉素A柱前衍生化毛细管气相色谱分析的方法,可以避开杂质的干扰。

  2  实验部分

  2.1  仪器与试剂

  6890N气相色谱仪(氢火焰检测器,美国Agilent Technologies)带有7683自动进样器,分流/不分流进样口; HP5MS熔融石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm, 0.25μm, 美国Agilent Technologies); BF2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司); 20200AB台式电热干燥箱(中国天津泰斯特仪器有限公司); Sartorius AG百分之一天平;HZQC空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); EYELA N1000型旋转蒸发仪(日本); 布氏漏斗及抽滤瓶; 7 cm定性滤纸;100 mL具塞三角瓶;100 mL鸡心瓶;防溅球; 1 mL注射器; 0.22 μm水系滤膜等。

  井冈霉素A标准品(93.6%,上海农药研究所提供),用超纯水配制成71.00 mg/L的标准贮备溶液置于4 ℃冰箱中备用;N,O双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA,分析纯,阿法埃莎公司);吡啶(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);三甲基氯硅烷(TMCS,化学纯, 国药集团化学试剂有限公司);氨水(分析纯,Ammonia Solution 25%,北京北化精细化学品有限责任公司),配制成V(氨水)∶V(水)=1∶9的提取液;甲醇(色谱纯, SK Chemicals, Korea)。

  2.2  色谱分析条件

  载气:高纯氮气,补充气(氮气):30.0 mL/min;空气:300.0 mL/min;氢气:30.0 mL/min;柱流速: 1 mL/min;进样量:2 μL,不分流进样; 进样口温度: 240 ℃;检测器温度:280 ℃;柱初始温度80 ℃(1 min)30 ℃/min280 ℃(10 min)。

  2.3  实验方法

  2.3.1 土壤样品前处理   采集北京周边地区农田中未施药的空白土壤,采集深度10 cm,充分混匀,保存于4 ℃冰箱中备用。

  准确称取10 g土壤于100 mL具塞三角瓶中,加入40 mL 10%氨水提取液,于20 ℃振荡箱中振荡1 h,振速约130 r/min。将土壤提取液减压过滤,以6 mL 10%氨水溶液分3次洗涤锥形瓶并转入布氏漏斗淋洗土壤,待提取液抽干后,将抽滤瓶中的滤液转入鸡心瓶,再用4 mL 10%氨水溶液分两次洗涤抽滤瓶,一并转入鸡心瓶,于60 ℃水浴下旋转蒸发浓缩。60 ℃容易导致提取液沸腾,旋转蒸发时要接防溅球,浓缩到近干,将最后一滴氨水转入1 mL注射器,再用0.8 mL甲醇洗鸡心瓶,一并转入注射器,经0.22 μm滤膜过滤于色谱进样瓶中,氮气吹干仪吹干,待衍生化。

  2.3.2  衍生化反应  用移液枪依次取0.1 mL N,O双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)、0.1 mL三甲基氯硅烷(TMCS)、0.2 mL吡啶加入经氮气吹干的进样瓶,试剂加入过程有白色气体冒出,迅速将进样瓶瓶盖旋紧,充分振摇后置于80 ℃电热恒温箱中反应30 min,30 min内取出小瓶振摇2~3次,待反应完全后供气相色谱分析。标准样品以同样方法衍生化。

  3  结果与讨论

  3.1  线性关系的测定

  将71.00 mg/L井冈霉素A标准溶液用超纯水梯度稀释配得71.00 、35.50、17.75、8.88和4.44 mg/L系列标准溶液。5个浓度的标准溶液各取400 μL分别装于色谱进样瓶中,氮气吹干水后进行衍生化反应并进行气相色谱测定,以井冈霉素A标准溶液浓度与衍生物峰面积作标准曲线,线性关系良好。线性方程为:Y=0.4633X-1.4183,其中Y为井冈霉素A衍生物峰面积,X为标准溶液浓度,相关系数为r=0.9983。

  在2.2色谱条件下,井冈霉素A衍生物的相对保留时间为12.2 min。以信噪比S/N=3作为仪器检出限时,此条件下仪器的最低检出浓度为4.4 mg/L,井冈霉素A标准品衍生物色谱图与仪器的最低检出浓度色谱图见图1。

  图1  井冈霉素A标准品衍生物色谱图(71.00 mg/L)(a)和仪器最小检出浓度色谱图(4.44 mg/L)(b)(略)

  3.2  提取条件的选择

  井冈霉素是强极性化合物,极易溶于水,在甲醇中也有很好的溶解度。实验对比了甲醇、V(甲醇)∶V(H2O)=9∶1、纯水3种溶剂对土壤中井冈霉素进行提取,结果显示,使用3种提取液都不能将土壤中的井冈霉素提取出来,而且使用甲醇作提取溶剂气相色谱分析时有一较大的杂质峰干扰,而使用纯水提取没有此杂质干扰(如图2)。

  图2  标准溶液(a)、甲醇提取(b)和纯水提取(c)的色谱图(略)

  常规溶剂并不能有效地从土壤中提取井冈霉素,原因可能是土壤对其存在轭合作用,这就是常说的结合残留。国际原子能利用委员会(IAEA)于1986年确定“用甲醇连续萃取24 h后仍残存于样品中的农药残留物为结合残留” [10]。本实验采取甲醇提取24 h后,井冈霉素仍未见检出,属于结合残留的范畴。农药可通过多种化学键与土壤组分发生吸附、络合或固定作用,结合残留主要存在于样品的具有多种官能基团的网状结构组分中[11]。土壤作为一种胶体状物质,疏松多孔,井冈霉素分子本身是一个多羟基糖苷类化合物,极易与土壤形成氢键结合残留。文献报道土壤中结合残留的释放方法有多种,如高温分解法和高温蒸馏法、酸碱水解法、超临界流体萃取法、化学释放法及微生物释放法等等[12]。本实验使用可加热的磁力搅拌器,分别采用甲醇和纯水对土壤进行4 h的沸腾回流提取,仍旧未能提取成功。

  近年来大量研究表明,土壤中的结合残留主要分布在土壤腐殖质中,主要有胡敏酸、富里酸和胡敏素。关于土壤有机质组分的萃取分离多采用碱提取、酸沉淀等方法来释放结合残留。井冈霉素的稳定pH范围是4~10,本实验采取10%的氨水(pH=9)作为提取溶剂,室温振荡1 h,提取回收率接近100%,土壤空白及添加回收色谱图见图3,说明碱液提取是最佳提取方法。实验了用40 mL提取液分别对10、20和30 g土壤进行提取,结果表明,40 mL提取液只能对10 g土壤中的井冈霉素完全提取;20 g土壤中提取回收率较低;30 g土壤中完全不能提取出来。故确定了10%氨水溶液为提取溶剂以及提取溶剂用量为40 mL/10 g土壤。

  图3  土壤空白(a)、标准溶液(50.00 mg/kg)(b)和土壤添加回收(添加量2.00 mg/kg)(c)的色谱图(略)

  3.3  衍生化试剂的选择

  最常用的气相色谱衍生化方法有硅烷化、酯化和酰化等。此外,烷基化、裂解、缩合和成环反应也是常用反应方法。根据糖类化合物多羟基的特点,采用硅烷化试剂衍生,硅烷化反应常用于含有ROH、RCOOH、RNHR等质子性基团的物质,原理是硅烷化试剂的强电负性原子与质子性基团的氢原子形成共价化合物而脱去,反应式如下:

  R3Si—X+H—R′R3Si—R′+HX

  最常用的硅烷化试剂有三甲基硅烷(TMS)、 三乙基硅烷(TES)、 三甲基氯硅烷(TMCS)、 N,N二乙氨基二甲基硅烷(DADS)及叔丁基甲氧基苯基硅烷(TBMPS)等。硅烷化反应通常在密闭的小瓶中进行,因为所有硅烷化试剂及其衍生物都易受潮气的水解作用,整个反应过程要求严格的无水环境。在大多数情况下,试剂本身就是很好的溶剂,需要溶剂时应避免使用含有活泼氢的溶剂,吡啶是最合适的溶剂。此外,二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃等也能做硅烷化反应的介质[13]。本方法使用三甲基氯硅烷(TMCS)做硅烷化反应的催化剂, N,O双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSA)作硅烷化试剂,吡啶作反应溶剂对井冈霉素A进行了定量分析。

  3.4  方法的添加回收率实验

  在空白土壤中添加井冈霉素A标准溶液,分别进行0.20、2.00 mg/kg两个浓度的添加回收率实验,每个浓度重复5次,按上述方法进行提取和气相色谱衍生化分析,测得结果列于表1。样品的平均回收率和相对标准偏差均令人满意。

  表1  井冈霉素A在土壤中的添加回收率(略)

  在最优色谱条件下, 方法的检出量为4×10-10 g,最低检出浓度为0.20 mg/kg。本方法操作简便,符合农药残留检测要求。

  【参考文献】

  1 Han XiLai(韩熹莱). Agricultural Encyclopedia, Volume of Pesticide(农业百科全书,农药卷). Agricultural Press(农业出版社), 1993: 145~146

  2 Zhu YongHe(朱永和), Wang ZhenRong(王振荣), Li BuQing(李布清). Thesaurus of Pesticide(农药大典). China Sanxia Press(中国三峡出版社), 2006:607~608

  3 Zhang CunZheng(张存政), He DanJun(何丹军), Luo AiLan(骆爱兰), Liu XianJin(刘贤进), Liu Min(刘敏), Ji LiLi(季丽莉). Journal of Nanjing Agricultural University(南京农业大学学报), 2005, 28(2):107~110

  4 Hu DeYu(胡德禹), Song BaoAn(宋宝安), Fang Tao(房 涛). Chinese Journal of Pesticides(农药), 1998, 37(7): 22~23

  5 Hsiao Y M, Lo C C. J. Agric. Food Chem., 1999, 47: 3723~3726

  6 He J, Chen S W, Ruan L F, Cao L L, Yao J, Yu Z N. J. Agric. Food Chem., 2003, 51: 7523~7527

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  8 Xu Hui(徐 辉). Journal of Shanghai Agricultural College(上海农学院学报), 1998, 16(2): 148~151

  9 Yao JunQing(姚君卿). Chinese Journal of pesticides(农药), 1984, 03: 42

  10 Ou XiaoMing(欧晓明), Fan DeFang(樊德方). Chinese Journal of pesticides(农药), 2006, 45: 10

  11 Lu Yi-Tong(陆贻通), Zhu Jiang(朱 江), Zhou Pei(周 培). Bulletin of Science And Technology(科技通报), 2005, 21: 3

  12 Guo JiangFeng (郭江峰), Sun HeJin(孙锦荷). Agroenvironmental protection(农业环境保护), 1996, 15(6): 270~273

  13 Sun YuQing(孙毓庆). Modern Chromatography and Its Application for Pharmaceutical Analysis(现代色谱法及其在药物分析中的应用). Beijing(北京): Science Press(科学出版社), 2005: 558

 

作者: 未知 2009-7-25
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