浊点萃取高效液相色谱法测定草莓汁中的多种农药残留

　　【摘要】  建立了浊点萃取(CPE)对草莓汁中的7种农药(克百威、异丙威、甲霜灵、杀扑磷、敌草隆、烯酰吗啉和苯噻酰草胺)进行萃取富集，然后用高效液相色谱紫外检测器进行检测分析的方法。所用的表面活性剂为非离子表面活性剂聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20)，该表面活性剂在一定条件下能够对分析物进行提取与富集。实验确定了CPE方法的优化条件：Tween20的浓度为3%(V/V）、硫酸钠和正丁醇的浓度分别为12%(W/V）和5%(V/V)、平衡温度为50℃以及平衡时间为40min；色谱条件：流动相为Ｖ(甲醇）∶Ｖ(水）＝ 70∶30，流速为0.6 mL/min，检测波长为215 nm。在上述实验条件下，在草莓汁样品的平均加标回收率为80.5%～92.8%，检出限是0.9～2.1 μg/kg。

　　【关键词】  浊点萃取，高效液相色谱，农药残留，草莓汁

　　Cloud Point Extraction for the Determination of Pesticides in Strawberry Juice by High Performance Liquid Chromatographic Detection

　　Chen JianBo，Liu Wei，Cui YanMei，Zhao DaoYuan，Yang MingMin

　　(College of Science，Nanjing Agriculture University，Nanjing 210095）

　　Abstract  The feasibility of employing cloud point extraction (CPE) as the separation and preconcentration of seven pesticides(carbofuran,  isoprocarb, metalaxy, methidathion, diuron, dimethomorph, mefenacet) from strawberry juice samples followed by HPLCUV analysis was demonstrated. The surfactant Tween20 was used to extract and preconcentrate the analytes. The optimum conditions of CPE were as fallows: 3% (V/V) Tween20, 12%(W/V)sodium sulfate， 5%(V/V) nbutanol, equilitration temperature 50 ℃, equilitration time  40 min; chromatographic conditions: mobile phase of methanolwater was 70∶30(V/V）, flow rate of 0.6 mL/min.  The detection wavelength was at of 215 nm.The recovery for the standard addition of the seven pesticides in the strawberry juice were 80.5%－92.8%. The limits of detection were 0.9－２．１ μg/kg。

　　Keywords  Cloud point extraction，high performance liquid chromatography，pesticide residue，strawberry juice

　　1  引  言

　　临界胶束浓度以上的表面活性剂水溶液在一定温度下加热、加盐会产生相的分离，形成透明的两相(表面活性剂胶束相和水相)。其中的胶束相可以富集样品中的待分析组分，这就称为浊点萃取法(cloud point extraction, CPE）。浊点萃取法与目标物的作用机理已有不少报道，但其机制还没有完全确定[1～4]。浊点萃取法与传统的萃取方法相比具有能够减少挥发性有机溶剂的使用，操作简单，快速，不需专门的装置等优点。浊点萃取法已经应用在环境样品中金属离子的测定[5,6]、蛋白质的分离与纯化[7,8]等领域。浊点萃取法作为农药残留前处理分析方法，报道不多，其处理的样品多为水样[9～11]。本实验将这一方法应用于草莓汁样品中农药的提取，并在CPE过程中加入了一定的有机添加剂，能明显降低表面活性剂的浊点温度，常温下就可以发生浊点现象,从而避免了热不稳定农药的降解。

　　国际上先后制定了草莓中的多种农药最高残留限量(MRL），如日本政府规定的草莓中一些农药的MRL为：克百威为3 mg/kg,甲霜灵为1 mg/kg，杀扑磷为0.2 mg/kg，敌草隆为0.05 mg/kg，烯酰吗啉为5 mg/kg等[12]。 从草莓汁中浊点萃取以上7种农药，然后用HPLC方法检测。实验结果表明，本方法符合以上7种农药残留检测要求，能够对果汁中可能存在的这7种农药残留进行检测。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂

　　LC20AT高效液相色谱仪、SPDM20A检测器、LCsolution工作站(日本岛津公司）;色谱柱为Lichrospher ODS C18(250 mm×46 mm, 5 μm）；HHS26S数显恒温水浴锅；SUPELCO固相萃取仪。

　　克百威、异丙威、甲霜灵、杀扑磷、敌草隆、烯酰吗啉和苯噻酰草胺纯度为94%～99%(江苏省农药研究所)；上述７种农药均用甲醇溶解，配制成浓度是400 mg/L的标准储备液，在冰箱中保存；聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(Tween20）,配制成30%(V/V）的水溶液；Na2SO4、CuSO4、正丁醇、丙酮均为分析纯，甲醇为色谱纯，实验用水均为二次重蒸水。

　　2.2  样品处理

　　2.2.1  浊点萃取法提取果汁中的农药

　　取市售草莓汁样品10 mL于25 mL刻度试管中，分别加入1.5 mL 30%Tween20水溶液、0.15 g CuSO4，用二次蒸馏水定容至15 mL，在70℃水浴中加热5 min，冷却至室温，过0.45 μm滤膜，将滤液转入20 mL离心管中，再分别加入0.75 mL正丁醇、1.8 g Na2SO4，摇匀，然后在50 ℃水浴中平衡40 min，可得到透明的两相；下层为水相，上层为表面活性剂富集相，农药即被增溶于该相中。吸去水相，剩余表面活性剂胶束层的体积约为0.5 mL，即所测样品的浓度提高了20倍。

　　2.2.2  固相萃取法提取果汁中的农药

　　取10 mL市售草莓汁样品于250 mL具塞三角瓶中，加入50 mL丙酮，超声提取15 min，转移到分液漏斗中，过滤。再用50 mL丙酮分数次洗涤残渣，并将洗液倒入分液漏斗中，合并滤液，并用无水硫酸钠干燥，然后将提取液于40 ℃水浴旋转蒸发浓缩至约1 mL，待净化。固相萃取柱经预活化后，加样，用5 mL甲醇在重力条件下洗柱，最后定容至5 mL，待用。

　　2.3  色谱条件

　　液相色谱紫外检测条件：流动相为V(甲醇)∶V(水)=70∶30，用前过0.45 μm滤膜，流速为0.6 mL/min，检测波长为215 nm;柱温为室温，进样量为20 μＬ。

　　3  结果与讨论

　　3.1  色谱分离条件的选择

　　研究了在不同的流动相配比下7种农药的标准溶液的分离，结果表明，以７０％甲醇作流动相时，只有峰2和峰3没有达到基线分离，其它几种农药都能较好的分离。在215 nm波长下，每种农药均有适宜的吸收强度，所以实验选择的检测波长为215 nm，结果见图1a。在草莓汁样品中加入以上7种农药，按2.2.1方法处理，按2.3色谱条件分离检测，结果见图1b。从图1a和图１b比较可以看出，CPE处理过程对这7种农药的色谱分析几乎无影响。

　　3.2  样品前处理条件的选择

　　3.2.1  表面活性剂浓度的选择

　　为了考察表面活性剂浓度对浊点萃取的影响，改变Tween20的浓度，其浓度为2%～7%(V/V）。实验表明，当表面活性剂浓度为3%时，各农药的回收率达到最大；当表面活性剂浓度再增大，对回收率基本没有影响，且在较大浓度时，增大了表面活性剂富集相的粘度，不利于色谱分离与分析，在以后实验中，Tween20的浓度为3%(V/V）。

　　3.2.2  添加剂的选择

　　实验了Na2SO4和正丁醇两种添加剂对浊点萃取的影响，结果表明，添加剂能够加快相分离行为、降低浊点萃取体系的温度。在加入Na2SO4和正丁醇后，Tween20在常温下即能够达到浊点，产生相的分离。但是较大量的添加剂能够降低富集倍数，而对回收率的影响较小。实验中所用Na2SO4、正丁醇的浓度分别为12%(m/V）和5%(V/V)。

　　3.2.3  平衡时间的选择

　　实验探讨了不同平衡时间对浊点萃取的影响。样品在优化条件下处理后，改变平衡时间，在水浴中分别平衡20～70 min。当平衡时间为40 min时，各个农药的回收率达到最大；当平衡时间过长，会导致浊点萃取向相反方向变化，表面活性剂相又慢慢消失。在两相完全分离的情况下，平衡40 min即可。

　　3.2.4  平衡温度的选择

　　温度对于表面活性剂胶束的性质，尤其是分相后形成的凝聚相体积和含水量均有较大的影响。样品按照前面优化条件处理后，在20～70 ℃水浴中分别平衡40 min。实验表明，当平衡温度达到50 ℃时，各个农药的回收率均达到最大；高于50 ℃后，回收率基本保持不变，故实验采用的浊点萃取温度为50 ℃。

　　3.3  回收率、精密度、检出限及线性范围

　　按照2.2.1节的方法，对７种农药的定量范围和标准曲线进行检测，以各农药的峰面积(Y）对浓度(X, mg/kg）绘制标准曲线，浊点萃取法的各种分析参数见表1。同时做样品加标回收率实验，每个浓度平行实验9次，结果见表2。按照2.2.2方法，计算固相萃取法的回收率，结果见表3。表1  浊点萃取法的各种分析数据（略）

　　比较表2、表3可以看出，浊点萃取法对7种农药的回收率比固相萃取法的回收率略高，可能是因为固相萃取法操作步骤较多、对被分析物造成损失，并且需要使用大量的有机溶剂，需要特殊的仪器装置。而浊点萃取法，仪器简单，不需专门的设备，操作简便，快速，无需使用大量的有机溶剂。表2  浊点萃取法的加入回收率（略）表3  固相萃取法的加入回收率（略）

　　3.4  样品检测

　　取不同产地的3种草莓汁样品，按2.2.1、2.3的方法没有检测出上述７种农药。分别向其中添加两种不同浓度的农药标准溶液，结果见表4。表4  不同草莓汁样品中农药检测结果(略)

　　【参考文献】

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