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液相色谱—电喷雾串联质谱测定蜂蜜中8种大环内酯类药物残留

来源:《分析化学》
摘要:【摘要】建立了蜂蜜中大环内酯类抗生素红霉素(ERM)、罗红霉素(ROM)、替米卡星(TIL)、泰乐菌素(TYL)、北里霉素(KIT)、交沙霉素(JOS)、竹桃霉素(OLM)及螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)的高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LCESIMS/MS)检测方法。样品经固相萃取提取、净化、反相液相色谱分离后进行质谱分析,在选择反......

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  【摘要】  建立了蜂蜜中大环内酯类抗生素红霉素(ERM)、罗红霉素(ROM)、替米卡星(TIL)、泰乐菌素(TYL)、北里霉素(KIT)、交沙霉素(JOS)、竹桃霉素(OLM)及螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ)的高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LCESIMS/MS)检测方法。样品经固相萃取提取、净化、反相液相色谱分离后进行质谱分析, 在选择反应监测模式(SRM) 下进行特征母子离子对信号采集。根据保留时间和母离子及两个特征子离子信息进行定性分析,以基峰离子进行定量。大环内酯类残留的检出限(S/N=3) 为 0.2 μg/kg,定量限为1.0 μg/kg,在5.0~200 μg/L时峰强度与质量浓度的线性关系良好(R2>0.99)。在2.0、10.0、20.0和40.0 μg/kg 4个添加水平下, 除个别药物外,大环内酯类的平均回收率范围为60%~130%;日内RSD<10%,日间RSD<15%。结果表明,该法简单、灵敏,特异性强,适用于蜂蜜中大环内酯类药物残留的分析确证。

  【关键词】  大环内酯类药物 蜂蜜 残留 固相萃取 液相色谱 质谱

  1  引言

  大环内酯类抗生素(MALs)是利用放线杆菌或小单孢菌生产的具有大环状内酯环的抗生素的总称,对革兰氏阳性菌和支原体有较强的抑制能力。MALs已经广泛用于畜禽细菌性和支原体感染的化学治疗[1,2]。据文献[3]报道,大环内酯药物可用于防治蜜蜂的美洲幼腐病(AFB)。由于大环内酯抗生素或其代谢产物都会有独特的变异性反应,药物在体内蓄积达到一定的浓度,可造成前庭和耳蜗神经的损害,导致眩晕和听力减退,严重者造成肝肾的严重损害[2]。许多国家也对我国的出口蜂产品中大环内酯类药物设定了相应限量要求,要求每种药物的残留限量不超过10 μg/kg。

  目前报道的检测大环内酯类的检测方法主要有高效液相色谱法[4]、薄层色谱法[2]、气/质联用法[2] 、液/质联用法(LC/MS)[5~9]。LC/MS是确证类似MALs这样高分子量和多官能团残留物的较理想方法,它既可用于MALs残留的确证分析,又能作为一种通用的高效能测定方法。但目前国内尚未见液/质联用法测定大环内酯类药物残留的研究报道。固相萃取方法既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取,又可用于净化、浓缩或富集,是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。

  蜂蜜是我国重要的出口农产品之一,也一直是各国对各种药物残留检测的重点产品。蜂蜜是由果糖和葡萄糖及其它一些特征的糖类物质和一些微量有机成分组成的水溶液。本实验对蜂蜜试样用缓冲液溶解后,用HLB固相萃取柱提取净化,洗脱液浓缩后用色谱流动相定容,液相色谱串联质谱仪测定。

  2  实验部分

  2.1  仪器与试剂

  液质联用仪由Surveyor液相色谱系统和ThermoFinnigen Quantum Ultra 三重四极杆串联质谱(电喷雾电离源( ESI))构成。液相系统包括自动进样器(Autosampler 1.3)、质谱泵(MS Pump 2.0),软件使用Xcalibur 1.4版;C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm,  i.d, Restek公司);氮气吹干仪( 美国Zymark公司);Milli Q去离子水发生器(美国Millipore公司);12通道半自动固相萃取装置(美国Supleco公司)。

  二次去离子水;甲醇(色谱纯)、碳酸钠和碳酸氢钠(分析纯);Oasis HLB固相萃取柱:(Waters公司, 60 mg,3 mL)。红霉素(ERM)、罗红霉素(ROM)、替米卡星(TIL)、泰乐菌素(TYL)、交沙霉素(JOS)、竹桃霉素(OLM)、螺旋霉素Ⅰ(SPMⅠ,Sigma公司,纯度≥95%);北里霉素(KIT)(日本Asahi公司)。分别用甲醇配成1.0 g/L的标准储备液,储存在4℃冰箱中。

  2.2  实验方法

  2.2.1  样品前处理方法  对无结晶的蜂蜜,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60℃的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,冷却至室温。置于样品瓶中,标记,密封,保存。

  准确称取蜂蜜试样(5.00±0.05 g),置于50 mL具塞离心管中,加入15 mL 0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3 (pH 9.3)缓冲溶液[8],于液体混匀器上快速混合1 min,使试样完全溶解。将混合液倒入下接Oasis HLB 柱的贮液器中,溶液以≤2 mL/min的流速通过Oasis HLB 固相萃取柱.待溶液完全流出后,用5 mL水洗离心管和贮液管并过柱,再用5 mL甲醇+水(甲醇∶水=4∶6)洗柱,弃去全部淋出液,抽干,用5 mL甲醇洗脱。收集洗脱液于50 ℃下用氮气吹干,甲醇+水(甲醇∶水=3∶7)定容至1.0 mL,过0.45 μm的滤膜到进样瓶中,供液相色谱质谱仪测定。

  2.2.2  液相色谱和质谱条件  液相色谱条件:流动相:水 (A)+甲醇(B);流速0.25 mL/min;梯度0~5 min 20%~95% B, 5~7 min 95% B, 7.1~9 min 20% B;柱温:室温;进样量25 μL。质谱条件:电喷雾离子源ESI,正离子扫描,选择反应检测(SRM),电喷雾电压-4500 V;雾化气压力0.060 MPa,气帘气压力0.060 MPa;辅助气流速5 L/min;离子源温度350℃;扫描带宽0.002 amu;扫描时间0.02 s (MS2)。

  3  结果与讨论

  3.1  大环内酯药物的质谱裂解特征

  大环内酯类化合物都具有含氮的氨基基团,在ESI源中,容易得到其带一个(MH+)或两个单位(M+2H+)正电荷的母离子。有文献报道,螺旋霉素选用带两个单位电荷离子作为母离子。实验发现,不同来源的标准品得到的母离子强度不同。生物发酵得到螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三种混合标准品,其带两个单位电荷的母离子强度比带一个单位电荷的母离子强度大;而纯的螺旋霉素I标准品带一个单位电荷的母离子比带两个单位电荷母离子强度大。本实验选择带一个单位电荷作为母离子。母离子进一步碰撞分裂后,产生特征的子离子。每种药物的质谱图如图1所示。

  图1  8种大环内酯类药物的质谱图(略)

  Fig.1  Mass spectra of the eight macrolides

  TIL: tilmicosin; SPMⅠ: spiramycin Ⅰ; ERM: erythromycin; ROM: roxithromycin; TYL: tylosin; KIT: kitasamycin; JOS: josamycin.

  根据欧盟EC657指令的规定,对于液质联用的方法,一个母离子(1.0识别点)加两个特征子离子(2×1.5识别点)可以满足对一个被分析物4个识别点的定性确证的要求。表1列出了8种大环内酯类化合物的母离子、子离子及其碰撞能量。

  表1  8种大环内酯的定性离子对、定量离子对、碰撞能量(略)

  Table 1  Precursor ions and product ions of the eight macrolides in the positive ion mode

  3.2  提取和分离条件的优化

  蜂蜜中除大量的果糖、葡萄糖等糖类物质外,还含有一些微量的如酚类等其它物质[7]。在样品提取过程中应尽量去除这些杂质。文献报道的主要有液液萃取和固相萃取方法。液液萃取的方法简单方便,但杂质较多。固相萃取方法相对成本较高,但提取和净化一步完成,有利用于实现自动化操作。

  在固相萃取时比较了HLB柱与C18柱提取后的回收率,发现没有明显差别。C18柱在提取过程中,如果柱子中的液体流干会严重影响提取效率,对操作要求较高。而HLB柱,成本比较贵,但操作简单。本实验中选择HLB柱进行固相萃取净化。

  实验中选择不同浓度及不同pH值的Na2CO3NaHCO3缓冲溶液(0.1 mol/L ,pH 9.3;0.5 mol/L ,pH 8.0;0.5 mol/L ,pH 9.3;0.5 mol/L ,pH 10.0;1.0 mol/L ,pH 9.3)提取加标蜂蜜样品(20 μg/kg),结果发现没有很大差别。本实验选用0.1 mol/L、pH 9.3的Na2CO3NaHCO3缓冲溶液来提取蜂蜜。

  蜂蜜样品首先溶于0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3(pH 9.3)缓冲溶液中,然后在Oasis HLB柱上净化。大环内酯类药物在酸性条件下(pH<4.0)不稳定。而在碱性条件下(pH 9.3)提取,既可以避免药物分解,又可以使带氨基的药物保持分子形式,提高药物的固相萃取回收率和稳定性。

  为尽量除去杂质,选择最优的净化条件。第二步洗涤采取加入5 mL不同浓度的甲醇水溶液(0、10、20、40、60、80和100%)进行实验。结果发现,当甲醇浓度≥60% 时,不但会将柱上吸附的杂质除掉,也会把大环内酯类药物洗脱掉。因此,采取40% 甲醇水净化除去色素,用100%甲醇洗脱。液质联用中对分离的要求不是很高。在兼顾分离和分析效率的基础上确定了8种药物的分离条件。8种药物加入量为20.0 μg/kg,获得良好的分离子流色谱图(图略),它们的保留时间为:TIL 4.77 min; SPMⅠ 4.81 min; OLM 5.73 min; ERM 6.30 min; ROM 7.12 min; TYL 7.33 min; KIT 7.97 min;JOS 9.40 min。

  3.3  线性方程、相关系数、检出限(LOD)和定量限(LOQ)的测定

  在选定的条件下,获得了8种大环内酯药物标准曲线的线性方程、相关系数和检出限数据如表2所示。

  3.4  方法回收率和精密度的测定

  3.4.1  不同添加浓度的回收率  由表3可以发现,本实验用于提取蜂蜜中的大环内酯类抗生素的方法,除替米卡星外,回收率稳定在60%~130%之间;日间精密度小于15%,完全满足日常分析检验的需要。

  3.4.2  不同来源的蜂蜜基质比较  我国地域广阔,蜂蜜品种众多。为了研究本方法的通用性,本实验还对不同品种的蜂蜜样品进行了加标回收实验。对菜花蜜(A)、荆条蜜(B)、混合蜜(C)、洋槐蜜(D)及野生蜜(E)进行加标实验(20 μg/kg),数据及计算结果如表4所示。

  表2  线性方程、相关系数、检出限(LOD)和定量限(LOQ)(略)

  Table 2  Linear equations and the correlation factors, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ)

  表3  方法添加回收率和日内、日间精密度(n=3)(略)

  Table 3  Recovery and intraday and interday precision of the method (n=3)

  表4  不同种蜂蜜的加标实验数据处理结果 (n=3)(略)

  Table 4  Recovery and precision of the method for the different honey samples (n=3)

  A. 菜花蜜(brassica campestris honey); B.  荆条蜜(chastetree honey); C.  混合蜜(mixed honey); D. 洋槐蜜(Black locust honey); E. 野生蜜(agrestal honey)。

  由此可见,本方法适用于检测不同蜂蜜品种中的大环内酯类药物的残留,通用性较好。

  【参考文献】

  1 Li Yan(李 岩),Shao Bing(邵 兵),Xu Suohong(徐锁洪). Chinese J. Health Lab. Tech.(中国卫生检验杂志), 2005, 15(10): 1275~1277

  2 Li Junsuo (李俊锁),Qiu Yueming (邱月明),Wang Chao (王 超). Analysis of Veterinary residue(兽药残留分析) . Shanghai(上海): Shanghai Science and Technology Press (上海科学技术出版社), 2002: 413~458

  3 Peng C Y, Mussen E, Fong A, Cheng P, Wong G, Montague, M A. J. Invertebr. Pathol., 1996, 67: 65~71

  4 Liang Jianhua (梁建华),Yao Guowei (姚国伟). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2003, 31(9): 1151

  5 Draisci R, Palleschi L, Ferretti E, Achene L, Cecilia A. J. Chromatogr. A, 2001, 926: 97~104

  6 Masakazu H, Harumi T, Kazuo T. Anal. Chim. Acta, 2003, 492 (1~2): 187~197

  7 Thomas S, Thompson D K, Noot J C, Stephen F. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2005, 19: 309~316

  8 Wang J. J. Agric. Food Chem., 2004, 52: 171~181

  9 Wang J, Leung D, Lenz S P. J. Agric. Food Chem., 2006, 54: 2873~2880

 

作者: 未知 2009-7-30
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