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【摘要】建立了一种专属、灵敏的气相色谱质谱分析方法，用于检测水果、蔬菜、饮料、粮谷类、坚果类和肉、蛋、奶类等多种类型食品中嘧菌酯、醚菌胺、嘧蟎酯、氟嘧菌酯、醚菌酯、Z苯氧菌胺、E苯氧菌胺、肟醚菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯和肟菌酯等11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量。对于不同类型的样品，使用不同有机溶剂对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂进行超声波提取，经凝胶渗透色谱对样品提取液进行净化、富集，采用气相色谱质谱法以选择离子监测模式进行定性，外标法定量。上述各种杀菌剂在0.05～5.0 mg/kg浓度范围内呈线性，相关系数r>0.99。在空白样品中，添加甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的回收率在60.3％～120.0％之间，精密度（RSD）为1.54％～13.41％。各组分检出限均在0.002～0.015 mg/kg之间。
【关键词】 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂 残留分析 食品 气相色谱 质谱 凝胶渗透色谱
本文系国家认监委检验检疫行业标准研制项目（No.2007B865）资助* E—mail: bohbl212@163.com
1 引 言
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（strobilurin fungicides）是近十年来全球农药界最具有发展潜力和市场活力的一类低毒、高效、广谱、内吸性杀菌剂，对几乎所有的真菌纲病害均有良好的活性。每年商品化的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂数量正在快速增加，该类杀菌剂在我国已有生产和使用。该类杀菌剂残留问题正在引起各国相关管理部门的重视，美国、加拿大、欧盟等许多国家或国际组织均制订了该类杀菌剂在食品和农产品中的残留限量[1～3]。该类杀菌剂残留问题有可能成为国外限制我国农产品出口的新一轮技术壁垒，所以研究该类杀菌剂残留量检测方法有重要的现实意义。
目前少有该类杀菌剂3种以上多残留测定方法的研究报道［４］，只有关于嘧菌酯单组分的检测方法研究报道[５～７]和1项测定嘧菌酯残留的检验检疫行业标准［８］，以及少量关于2～3种该类杀菌剂残留量同时检测的研究报道[９～1１]。这些方法净化步骤复杂，检测灵敏度低，不能对定性定量结果进行确证。当前农药残留检测技术普遍趋向于进行选择性定性确证和高灵敏度定量进行多组分残留分析。本实验选用梨、葡萄、苹果、蘑菇、甘蓝、黄瓜、茶饮料、橙汁、大米、板栗、牛奶、鸡蛋、鸡肉、牛肉和猪肉等食品为分析对象，采用凝胶渗透色谱技术进行净化、富集，气相色谱质谱法测定了11种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。杀菌剂的分子式、分子量等基本信息参见表1。表1 １１种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（略）
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
GC6890N/5973N型气相色谱质谱联用仪（GCMS），配置电子轰击（EI）源（美国安捷伦）；凝胶渗透色谱515GPC净化系统，配置515泵、717自动进样器、紫外检测器、馏份收集器（美国沃特斯公司）；T25B高速组织捣碎机（德国GMBH & CO. KG）；超声波振荡器、涡旋混匀器、离心机、旋转薄膜蒸发仪（上海医疗器械厂）；11种杀菌剂标准品（纯度≥98%，德国Ehrenstorfer Quality公司）；标准储备液：准确称取标准品50.0 mg，用甲苯溶解，转移至50 mL棕色容量瓶中，并定容至刻度，该溶液浓度为1000 mg/L。－18 ℃避光保存。实验中按需要稀释，现用现配。甲苯、环己烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇和三氯甲烷（均为农残级，德国默克公司），NaCl（分析纯，北京试剂厂），无水Na2SO4(分析纯,北京试剂厂，用前在650 ℃灼烧4 h，置于干燥器中冷却后备用）; Ｖ（环己烷）∶Ｖ（乙酸乙酯）＝1∶1。水为二次蒸馏水。
2.2 实验方法
2.2.1 气相色谱质谱条件
色谱柱：HP5 ms弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色谱柱温度程序：160 ℃（1 min）15 ℃/min280 ℃（4 min）10 ℃/min300 ℃（10 min）；载气：高纯氦气，纯度≥99. 999%；载气程序流速：0.8 mL/min保持10 min，以0.5 mL/min升至1.5 mL/min，保持12 min； 进样口温度：280 ℃；溶剂延迟:4 min； 进样方式：无分流进样，1.5 min后打开分流阀；进样量： 2.0 μL。
电离方式：EI；电离能量：70 eV；四极杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；质谱仪接口温度：280 ℃；检测方式：选择离子监测模式（SIM）；监测离子（m/z）见表2。表2 １１种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂保留时间、监测离子(m/z)及丰度比（略）
2.2.2 试样制备
抽取各类样品约 500 g。对果蔬类和肉类样品，将可食用部分切碎，加工成浆状。对粮谷和坚果类样品，将可食用部分用粉碎机磨碎并通过2.0 mm圆孔筛。混匀，均分成两份分装入洁净的样品瓶内，密闭并标明标记。
2.2.3 提取
（１）水果、蔬菜、饮料类 称取15.0 g试样于50 mL塑料离心管中，加入5 g NaCl，涡旋混匀 1 min，加入30 mL环己烷乙酸乙酯，再涡旋混匀 1 min，超声提取10 min，以4000 r/min离心10 min。 取上清液过填装有5 g无水Na2SO4的漏斗，分取20 mL滤液（相当于10 g样品）放入鸡心瓶中。(2)粮谷类、坚果类 称取15.0 g混匀的试样于50 mL塑料离心管中，加入5 g NaCl， 30 mL乙腈，涡旋混匀 1 min，超声提取10 min，以4000 r/min离心10 min。取上清液过填装有2 g无水Na2SO4的漏斗，分取20 mL滤液（相当于10 g样品）放入鸡心瓶中。(3)肉类和动物内脏 称取15.0 g混匀的试样于50 mL塑料离心管中，加入5 g NaCl，涡旋混匀 1 min，加入30 mL乙腈，再涡旋混匀 1 min，超声提取10 min，以4000 r/min离心10 min。取上清液过填装有5 g无水Na2SO4的漏斗，分取20 mL滤液（相当于10 g样品）放入鸡心瓶中。(4)蛋类、奶类 称取10.0 g混匀的试样于50 mL塑料离心管中，加入5 mL甲醇、 10 g 无水Na2SO4和20 mL三氯甲烷，涡旋混匀 1 min，振荡20 min，以4000 r/min离心10 min。用移液器吸取下层三氯甲烷层，过填有5 g无水Na2SO4的漏斗，收集于鸡心瓶中。再加入20 mL三氯甲烷，重复上述步骤进行二次提取。用20 mL乙腈分3次冲洗漏斗和无水Na2SO4，合并滤液于鸡心瓶中。
将鸡心瓶内溶液在40 ℃以下水浴减压浓缩至近干，进行净化。
2.2.4 净化
用4 mL环己烷乙酸乙酯溶解鸡心瓶中残留物，转移至GPC进样瓶中，供GPC净化用。
GPC条件：采用bio beads (SX3)凝胶净化柱，流动相为环己烷乙酸乙酯，流速4 mL/min，检测波长254 nm，进样体积为2 mL。收集第15～20 min时间段内的洗脱液至鸡心瓶中。将鸡心瓶中收集的洗脱液在40 ℃以下浓缩至近干。用1.0 mL环己烷乙酸乙酯溶解鸡心瓶内残留物，转移到GC进样瓶中，供GCMS检测。
2.2.5 检测
在2.2.1所述气相色谱质谱条件下进样测定，11种杀菌剂的参考保留时间约为7.9～15 min。各杀菌剂保留时间、监测离子及丰度比详见表2。标准品的选择离子总离子流图见图1，几种典型样品的空白及样品添加残留限量水平的总离子流图见图2。
图1中，唑菌胺酯（峰号91，92）出现双峰，在不同浓度范围和不同色谱条件下，两个峰的面积比例有所不同。测定唑菌胺酯时，两个峰的选择离子丰度比可共同作为定性的依据，并可根据实验条件下标准溶液出峰的实际情况选择一个峰进行定量。本实验研究过程中选择第一个峰作为定量依据。
3 结果与讨论
3.1 提取条件的选择
本实验针对样品基质的不同性质，采用了不同的有机溶剂进行提取。根据杀菌剂的溶解特性，实验对比了用Ｖ（乙酸乙酯）∶Ｖ（正己烷）＝1∶1，Ｖ（乙酸乙酯）∶Ｖ（环己烷）＝1∶1，乙腈，Ｖ（二氯甲烷）∶Ｖ（丙酮）＝9∶1作为溶剂的提取效果。经实验筛选，用乙酸乙酯环己烷作为水果、蔬菜和饮料类样品的提取溶剂。对于粮谷类、坚果类样品及肉类样品，在加入饱和NaCl的条件下，乙腈与水层分层快，基质背景相对干净，提取效率最高，故选用乙腈作为粮谷、坚果类及肉类等样品的提取溶剂。在涡旋混匀后，用超声波提取可获得稳定、满意的回收率。对于蛋、奶类等特殊样品，先用甲醇沉淀蛋白质，再用无水Na2SO4脱水、三氯甲烷提取，得到满意回收率。
3.2 净化方法的选择
根据甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的结构特点和文献报道［1～3］，样品提取溶液的净化方法主要有凝胶渗透色谱（GPC）法［１］、基质固相扩散（MSPD）法［２］、固相萃取（SPE）法［３］等。实验对比研究了用硅胶固相萃取柱、EnviC18柱、EnviCarb+SepPak氨基柱和GPC的净化效果。结果表明，各类样品均适合采用GPC净化，基本没有干扰峰。
3.3 质谱条件的优化
由于这11个组分的分子离子峰都很弱，在选择监测离子时只能选用丰度较高，且分子量较大的碎片，如嘧菌酯，选择m/z 344，388，372，403为监测离子，其中m/z 344为基峰。对阳性样品采用保留时间与特征选择离子丰度比双重定性。将样品溶液按照GCMS条件进行测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准溶液中某杀菌剂相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所有选择离子均出现，而且所选择的离子丰度与标准品的离子丰度比在允许误差范围内（见表3），则可判断样品中存在这种杀菌剂。如果不能确证，应重新进样，以扫描方式（如果有足够的灵敏度）或采用增加其它确证离子的方式来进一步确证。实验表明，本方法所选的监测离子灵敏度高，抗干扰性强，定量准确。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差（略）
3.4 方法的线性关系及测定低限
在本方法所确定的仪器分析条件下，取一系列不同浓度的杀菌剂标准溶液，以仪器响应峰面积对杀菌剂的浓度进行线性回归。按照S/N=10计算，得出各杀菌剂在食品中的定量限（limit of quantitation, LOQ）；按照S/N=3计算，得出各杀菌剂在食品中的检出限(limit of detection, LOD)，结果见表4。表4 11种杀菌剂的回归方程、相关系数和线性范围（略）
3.5 回收率、精密度和稳定性实验
采用标准添加法，在空白样品中，添加３个浓度水平的杀菌剂标准品溶液，每个添加水平平行测定6～8次。实验表明，方法的回收率在60.3％～120.0％的范围内，测试精密度（RSD）介于1.54％～13. 41％之间。样品溶液在当日12 h内重复进样，各组分日内RSD均不大于4.5％; 5 d内重复进样，各组分日间RSD均小于10％。
本方法经甘肃出入境检验检疫局、陕西出入境检验检疫局、河南出入境检验检疫局、中国科学院西北高原生物研究所5家单位实验验证。实验表明，5家验证单位测试的各种杀菌剂回收率均在69.0％～120.0％之间，实验室间精密度RSD为3.29％～15.32％，本方法准确可靠。
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