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【摘要】 介绍了流体动力色谱（HDC）和障碍色谱（SC）及其在生物、化工分离中的研究进展，着重于它们的分离原理、理论发展及二者之间的联系与转化，引用52篇文献。
【关键词】 动力学液相色谱, 流体动力色谱, 障碍色谱，DNA分离，评述
Hydrodynamic Chromatography and Slalom Chromatography
and Their Applications
LI JianJun, Liu Peng, GENG XinDu
(Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecule Chemistry of Ministry of Education,
Institute of Modern Separation Science, Shaanxi Key Laboratory of Modern Separation Science,Department of Chemistry, Northwest University, Xi′an 710069)
Abstract Hydrodynamic chromatography(HDC) and slalom chromatography(SC) called as dynamic liquid chromatography(DLC) were introduced and reviewed, mainly for the recent development of separation principle, theoretical model, and applications. Fifty two references were cited.
Keywords Dynamic liquid chromatography, hydrodynamic chromatography, slalom chromatography, deoxyribonucleic acid separation, review
1 引 言
随着生命科学研究的不断深入，液相色谱法(LC)在分离纯化多肽及蛋白质方面的应用也得到了迅速地发展，尽可能提高其分离度已成为LC研究中最重要的课题之一[1,2]。多年来，研究溶质组分的色谱保留行为基本上依据热力学因素，即根据各组分在固定相和流动相中的分配系数的差异实现对组分的分离，并且假定组分在该二相间的分配或吸附平衡是瞬时完成的。然而，早在1956年，荷兰学者Van Deemter便提出了色谱过程的动力学理论——速率理论[3]。他将色谱过程视为一个动态的非平衡过程，研究分离过程中的动力学因素对峰展宽的影响。此后，Giddings等[4]在Van Deemter方程的基础上，提出了LC的速率方程，即Giddings方程，他们认为溶质在流动相和固定相转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际上组分传质速度是有限的，说明分离中总是存在着动力学的非平衡过程。液相色谱的分类是依据溶质与固定相之间的作用特征，如电荷作用的离子交换色谱，疏水相互作用的疏水相互作用色谱和反相色谱，亲合作用的亲合色谱及分子大小的尺寸排阻色谱等。本文介绍的流体动力色谱（hydrodynamic chromatography, HDC）和障碍色谱（slalom chromatography, SC），其溶质均与固定相之间的作用特征无关，或关系甚小，而主要与流动相的流动特征有关，或是基于动力学因素发展起来的两种新的色谱方法，二者通称为动力学液相色谱法。目前, 它们已经在测定和分离聚合物、多肽、DNA和生物大分子方面广泛应用。文献[5]从与SEC 比较的角度简要地介绍了HDC和SC的分离原理及二者之间的不同点。本文详细并系统地说明了HDC和SC的分离原理、模型、理论发展、仪器设备和最新应用，并探讨了HDC与SC之间的联系及相互转化。
2 流体动力色谱（HDC）
HDC是Small等20世纪70 年代初就已开发出的一种可同时测定聚合物或胶体乳胶粒的直径及其分布的方法[6~8]。他们采用了无孔刚性固体颗粒填充色谱柱，待分离乳液在高压下通过色谱柱时，由于不同大小的溶质所受到的水动力效应的不同，其乳液在流动相中的移动速度也不同，从而实现了聚合物或胶体悬浮液的分离。Mori 等[9]进一步发展和完善了HDC, 并将其应用到某些天然高分子的分离。后来人们发现在一根直径为几百微米的毛细管中同样也可实现不同粒径混合物的分离[10]。这种采用毛细管，而不是填充柱作为分离柱的分离方法拓宽了HDC的应用范围，这在理论研究和实际应用上都有着非常重要的意义。用内径小于10 μm 的毛细管（称其为微毛细管）, 其分离机理与内径大于10 μm 的毛细管略有不同，文献[11~14]对微毛细管HDC进行了详细的理论探讨和应用研究。
2.1 HDC的原理
2.1.1 HDC柱
毛细管HDC 和填充柱HDC所需色谱装置大体相同。二者的区别在于毛细管HDC采用管径不同的毛细管作为分离色谱柱，而填充柱HDC 则使用无孔刚性固体颗粒填充的色谱柱。相对于毛细管HDC, 填充柱HDC 的设备简单，操作简便，尤其是检测手段的简化，通常使用紫外检测器便能满足要求。而毛细管HDC受到进样量和检测浓度的限制，要求检测器较为灵敏，通常使用高灵敏度紫外检测器或其它手段，如电位分析、激光激发荧光法及激光光散射法等[15]。
2.1.2 HDC分离模型
尽管HDC包括了前述的两种主要模式，毛细管HDC和填充柱HDC，而大部分有关HDC的理论都以前者为主[16,17]，由于可将填充HDC 颗粒间的间隙视为毛细管体系，故填充HDC与毛细管HDC具有相同的分离模型。HDC的分离机理为：当流动相从填料颗粒间经过时，由于水动力效应的存在使其流型为层流抛物面型，溶质在这种情况下的分离主要是借助于靠近填料颗粒表面的低流速区域所产生的排斥效应，大的溶质分子由于受到的排斥效应大于小溶质分子，更容易远离填料颗粒表面而进入高流速区域，这样大分子溶质的移动速度大于小分子溶质，从而先于小分子被洗脱出来。有多种模型描述了溶质在HDC中的保留行为，最简单的仅考虑了几何学效应，而常用的模型是DiMarzio 和Guttman[16,18]及Brenner和Gaydos[17]依据几何学原理而提出的保留时间和溶质大小的关系。如图1所示，溶质分子在毛细管内的迁移可用式（1）来表示：
R=(1+Bλ－Cλ)－1（1）式中，R=tm/t0为溶质的保留值与无限小的标记物的保留值之比，也称之为相对保留值；λ=de/dpor, de为溶质的有效直径，dpor 是毛细管的直径。B和C均为与几何学有关的常数；C值介于0.5~5之间[１９]，在填充柱里C值介于2.7至2.8之间。
从式（1）看出，粒径不同的颗粒的相对停留时间是不同的，这样具有不同大小颗粒的溶质便可用HDC法进行分离。由于大分子先于小分子被洗脱出来，因此，虽然它所用分离原理与尺寸排阻色谱（SEC）不同，但其洗脱顺序却与SEC相同。
需要指出的是，在式（1）的推导过程中将被测粒子假定为刚性的不旋转微球，而实际上对于流动体系中的粒子来说，其上下所受的力是不平衡的，在力矩的作用下将发生旋转, 这种转动又会影响其流动速度。这个现象最早由DiMarzio[１６]和Brenner[１７]等论及。
2.2 HDC的发展和应用
HDC要求溶质分子的大小与流经管道直径的比值不应小于0.01，一般介于0.01~0.35之间[2０]。在HDC提出的初期，使用小孔径的毛细管(50~500 μm i.d.)，或者使用填充10~20 μm填料的填充柱，其内部管道相对较大，因此它们仅局限于分析一些较大的溶质，如纤维和固体颗粒[2１，２２]。一般来说, 采用小内径的毛细管，或非常小的粒径均匀的微球作为填料时可显著提高HDC 柱的柱效，可使用内径更小的（1~5 μm）的毛细管和更小颗粒的填料（1~1.5 μm）[１９，23]来提高HDC的分离度。如Stegeman等[２４,２５]利用粒径范围在1.4~2.7 μm 单分散SiO2 微球为填料，较好地分离了聚苯乙烯颗粒、胶体SiO2 颗粒和蛋白质等。考虑到HDC 的分离机理在SEC中同样存在，故可将HDC与SEC结合, 从而拓宽所分离溶质分子量的范围。Cheng等[2６]利用粒径不同的玻璃微球为填料在填充柱中分离聚苯乙烯颗粒, 以此讨论了SEC和填充柱HDC之间的异同。Stegeman 等[２７]利用填充有多孔的SiO2颗粒和苯乙烯与二乙烯基苯交联共聚物颗粒的填充柱分离了聚苯乙烯颗粒，认为小分子量聚苯乙烯颗粒主要按SEC 机理分离，而高分子量聚苯乙烯颗粒则按HDC 机理分离，分子量范围可扩充至102~107之间。这样HDC的应用范围覆盖了SEC的范围[1３,２８]。
分析分离仪器的微型化是当今科学仪器发展的趋势，可以减小试剂消耗、提高分离分析效率和缩短分析时间。但是，使用小内径的毛细管会增加检测的难度[1３,1４]。为解决这个问题， Chmela 等[２９,3０]设计了芯片HDC装置，采用荧光检测，在3 min内完成了荧光纳米级微球的分离与检测。由于硅微技术可以提供准确的几何形状，硬度高，且耐有机溶剂和高温腐蚀，所以该体系使用1 μm×1000 μm(深和宽)的硅刻槽作为分离管路，连接体积为300 pL的进样器，并采用压力驱动流动相。该体系可提供十万个理论塔板数，已用来分离聚合物和生物大分子颗粒，真正达到了芯片实验室的程度，并定性地验证了HDC理论。然而他们认为这种保留和扩散的模型需要从定量的角度上加以描述和改进。Blom等[3１]也设计了熔融硅胶板状的紫外检测芯片HDC装置，使用69 mm ×0.5 mm×1 μm的分离管道连接150 pL进样器，其检测池的深和宽皆为30 μm，用此装置分离了粒径为26~155 nm的荧光分子和聚苯乙烯混合物，并描述了平面HDC保留与扩散行为以及壁效应对扩散的影响。上述两种芯片装置中的检测器与分离管路结合在一起，因此两者之间无死体积，这样大大减小了溶质峰的柱外扩散，有效地提高了分离效率。
3 障碍色谱（SC）
3.1 SC柱及分理原理
3.1.1 SC柱
SC所用仪器设备与常规HPLC所用设备基本相同。由于溶质在SC中的分离与填料的孔径和化学性质无关，所以SC对色谱柱的要求相对简单。已报道有使用C1反相柱[３２]，凝胶渗透色谱柱和[3３,3４]和离子交换色谱柱[３5]，流动相与SEC所用流动相相同，有时为了消除色谱柱的微弱的疏水作用，加入了5%~20%的有机溶剂，如乙睛。
3.1.2 SC分离模型
SC是在1988年依据动力学原理提出的一种新颖的方法，用于分离分子量相对较大（>5 kbp）的DNA分子[３６,37]。一般认为，SC的分理机理是：DNA分子的分离主要依靠流速和填料颗粒的大小而非填料的孔径和化学性质[3８]。填料的作用仅被用来形成填料之间的网状空隙，当DNA分子进入色谱柱，它需要不断绕过填料颗粒的球型障碍，就像障碍滑雪一样，DNA分子越大或填料颗粒越小，则DNA分子穿出色谱柱也越困难。这样大的DNA分子在填料颗粒间的移动速度小于小的DNA分子，最终在小分子之后被洗脱出来[3９]。 Guillaume等[4０]对SC的机理进行了研究，提出了DNA分子在SC里分离的模型，并对该模型进行的验证[4１]。该模型给出了相对保留值与流动相流速的关系：τ＝ψ(e－kv+kv－１）＋τˇ（２）式中，τ为流速在v时DNA分子的保留时间与其完全舒展时（对应于其最高流速时）的保留时间的比值，ψ，k为相应的常数，τˇ为最低流速时的τ值。从式（2）看出，SC模式中溶质的保留值是流速的函数。他们从理论上推导出的与实验得出的τ进行了比较，结果一致，并给出了τ值与流速v的关系图。
Hirabayashi等[3９]证明温度也是影响SC分离的重要因素，原因在于流动相的粘度大小与温度有关。Peyrin等[4２,4３]根据溶液粘度与温度之的关系给出了在SC中温度影响DNA保留行为的模型。
3.2 溶质保留与分离对流速的依赖性
SC中两个DNA片段的分离可以用式(3)来描述[3９,４4]：
RRT=tR/tNR(3)式中，RRT为溶质的相对保留时间，tR为溶质的保留时间，tNR为死时间或不保留组分的保留时间。
由于流速对DNA分子伸展性的影响[４4]，流动相对填料颗粒间的流体动力学力（hydrodynamic force）对DNA分子的保留起着重要的作用，随着流速逐渐增大，相对保留时间（ＲＲＴ）增长；流速增大到一定程度后ＲＲＴ趋于稳定值。Hirabayashi[３８，３９]和Boyes[３７]等进行了验证。Peyrin进行了理论推导[４4]，并指出流动相流速的增加提高了分离的效率，减小了分离时间，这也是其相对于平衡色谱的重要优点。
3.3 SC理论的发展和应用
自1988年SC提出以来，虽然发展很快，但其应用范围较窄，且多集中在SC理论研究和DNA分子片段的分离方面。SC为处理和分析大的DNA分子提供了一个新的技术平台[４５]，这种方法最大的特点就是溶质的分离是依靠于流体力学现象而非热力学中的溶质在固定相和流动相之间的化学平衡[３５,3９]。在这种模式里，流动相相对较高的流速会在柱子内填料之间的空隙间形成流速梯度，大的DNA分子由于随流动相移动得速度小，比小的更难通过填料颗粒，这样小分子先于大分子被洗脱出来，其洗脱顺序恰恰与排阻色谱模式相反[４６]，显著影响溶质保留值的是各种流体力学因素有固定相颗粒的大小、流动相的流速和温度，而化学因素有固定相颗粒的化学性质，孔径和溶剂的疏水性并不是影响分离的关键因素[４７]。Hirabayashi 等[４７]使用两种CapcellPak反相填料和5种 Hypersil3反相填料验证了SC机理在使用反相色谱柱条件下的可行性，发现在流动相的盐浓度增加时，DNA分子的保留值增大，其分离度也增大，他们认为这是一种SC和HIC同时存在的混合分离模式。然而Rittich 等[４８]在使用HEMABIO1000填料研究流动相盐浓度对分离的影响时，认为盐浓度对分离几乎没有影响。SC最主要的优点在于快速和相对简单的操作，如在使用凝胶色谱柱时，用SC能在2 min内完成分子量分别为4、9和23 kb的DNA碎片的分离[45]， 增加流速可以进一步缩短分离时间。然而SC的分辨率却低于SEC。为了提高其分辨率，Peyrin等[４4]提出了描述SC分离DNA分子的模型，得出流动相的粘度是影响DNA在SC分离中的重要因素。
Hirabayashi等[４９]进一步系统地研究了SC中DNA分子的构型、温度及溶剂的粘度对DNA分子保留的影响。结果表明，溶剂的粘度决定了DNA分子的保留程度，DNA分子构型影响其在SC中保留的是其分子长度，而非分子量，同时溶剂的粘度也和流速一样是影响DNA分子保留的主要因素。
4 HDC与SC的异同点及联系
HDC主要利用在填料颗粒之间的空隙中产生的平流层来进行分离。无规则盘状聚合物大分子的分离依赖于其有效半径reff与填料空隙的有效管径的比值。当流速增加时，溶质分子会拉伸并变形从而导致该比值的减小[2３]， 而这种变形会随着流动相流速、粘度和溶质分子体积增大而增加，当该比值大于一定程度时（＞0.35），无法完成溶质的分离[１９]。而SC的分离强烈依赖于流动相产生的水动力效应，DNA分子在通过颗粒间的时候会发生形变和舒展，这样在SC中，DNA分子的RRT才会与DNA分子的大小有一一对应的关系,且为颗粒直径的函数[4４]，故HDC与SC可相互转换[３２]，即当溶质分子为盘状结构且流速较低时，此时溶质的盘状形状未发生变化，分离按照HDC进行；随着流动相流速、溶质分子的体积增大到一定程度时，分离模式从HDC机理转为SC机理，此结论在分离DNA片段[5０]和蛋白质[5１]中得到了证实。
5 展望
HDC和SC借助于填料颗粒间的水动力效应对溶质进行分离。由于在分离过程中不需要满足溶质与固定相之间的化学平衡，这样消除掉了溶质与填料颗粒间的传质过程。因此，提高了分离速度，使用流动相和SEC相同，对环境污染较小。由于分离只与动力学因素——流动相流速、粘度和填料粒径有关，分离操作较为简单。其“溶质保留值与流速之间有依赖关系”的结论为提高色谱分离度提供了一条新思路。从动力学上研究溶质的分离给现代分离科学开辟了更为广阔的遐想空间。如：动力学因素改变时，溶质在各种分离模式中的分离情况、峰容量、分离度和洗脱顺序会有何不同？溶质的分离度和流动相流速之间有何联系？本实验组研究了反相模式下动力学因素，即：流速对细胞色素C的肽谱的影响[５２]，发现在不同流速时，肽谱的分离情况、峰容量和分离度也各不相同，甚至部分溶质的洗脱顺序也发生了变化，还发现了两种变化规律，即溶质相对保留值（RRT）与流动相流速之间存在双对数线性关系：log(RRT)=a+blog(v)（4）以及所得该两个线性参数，a与b之间的的线性关系：a=c+db（5） 该结果在液相色谱指紋图谱研究和蛋白质组学中分离低丰度蛋白时有潜在的应用价值。目前由于HDC在操作过程中需要控制的流速较低，因此对仪器的要求较高，并且自SC提出以来，已发表的论文多集中在理论研究上，实际应用多限于分离一些DNA分子片段，因此二者的用途有待进一步发展和开拓。
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