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多维色谱串联质谱分析肝癌患者血浆中的低丰度差异蛋白

来源:《分析化学》
摘要:【摘要】建立了分析肝癌患者血浆中低丰度差异蛋白的新的多维色谱串联质谱方法。以5例肝细胞癌(HCC)患者血浆为研究对象,选用免疫亲和色谱AgilentMARSSpinCartridge去除血浆中6种主要高丰度蛋白。离线RP²。HPLC预分级血浆低丰度蛋白并收集差异表达蛋白组。...

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  【摘要】 建立了分析肝癌患者血浆中低丰度差异蛋白的新的多维色谱串联质谱方法。以5例肝细胞癌(HCC)患者血浆为研究对象,选用免疫亲和色谱Agilent MARS Spin Cartridge去除血浆中6种主要高丰度蛋白;离线RP²HPLC预分级血浆低丰度蛋白并收集差异表达蛋白组;液相色谱²芯片(HPLC²CHIP,包含一支纳升级Zorbax 300SB²C18富集柱和一支纳升级Zorbax 300SB²C18分析柱)富集、分离差异表达蛋白组胰酶酶解肽混合物,线性离子阱质谱在线分析,以Spectrum Mill MS Proteomics Workbench自动分析MS和MS/MS数据后在UniProtKB/SWISS²PORT数据库中进行搜索,鉴定得到27种差异蛋白,其中23种蛋白与各种疾病或肿瘤相关,IMP3、ARNT2和GRIP1可能成为诊断HCC的潜在生物标志物。

  【关键词】  肝癌 血浆蛋白 免疫亲和色谱 反相色谱 二维纳流芯片液相色谱离子阱质谱 生物标志物

1  引言
   
  肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),简称肝癌,它是世界上致死率最高的恶性肿瘤之一[1,2] ,寻找特异性的诊断标志物对于早期诊断和治疗HCC患者、提高病人存活率、提高预期治疗效果具有重要意义。人血液含有来源于几乎所有细胞、组织、器官的蛋白,可以直接反映机体的病理、生理状况,是发现与各种疾病相关生物标志物的最有价值样本之一[3]。目前,血清甲胎蛋白(α²fetoprotein, AFP)是应用最广、研究最清楚的筛选HCC的生物标志物,但其敏感性和特异性较差[4]。新发现的HCC血浆生物标志物短期内还难以在临床上应用[5]。
   
  蛋白质组学为寻找HCC血浆生物标志物研究提供了新颖的思想和策略[6]。近期研究表明,多维分离策略可以分析鉴定更多的血浆低丰度蛋白,从而显著提高发现肿瘤血浆生物标志物的可能性[7]。
   
  本研究采用多维色谱串联质谱分析技术,以HCC患者血浆为研究对象,选用免疫亲和色谱Agilent MARS Spin Cartridge去除血浆中6种主要高丰度蛋白、离线RP²HPLC预分级血浆低丰度蛋白并收集差异表达蛋白组;通过HPLC²Chip富集、分离酶解肽混合物,线性离子阱质谱途径在线鉴定差异蛋白,为从血浆中筛选诊断HCC的新颖标志物提供了可行的技术路线。

  2  实验部分

  2.1  仪器与试剂
   
  多重亲和去除系统(MARS, Agilent High Capacity Multiple Affinity Removal System Spin Cartridge, Hu²6HC)(美国Agilent公司);ZORBAX 300SB²C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Agilent公司);SIGMA 3k30高速冷冻离心机(美国Sigma公司);ALPHA 1²2LD真空冻干机(德国Marin Christ 公司);SHIMADZU 10AVP高效液相色谱仪(日本岛津公司);Agilent二维纳流液相色谱芯片²离子阱质谱系统(HPLC²CHIP/MS system,美国Agilent公司);超纯水装置(重庆利迪公司);Amicon Ultra²4(5 kDa)离心超滤装置(美国Millipore 公司)。
   
  Starter Reagent Kit for Spin Cartridges(美国Agilent公司);乙腈(HPLC级,江苏汉邦公司);三氟乙酸(TFA,高纯, 德国Merck公司);尿素(高纯,上海生工公司),蛋白质Marker(美国Bio²Rad公司)。

  2.2  实验方法

  2.2.1  研究病例  按照原发性肝癌诊断标准[8],选取5例HCC患者(来自重庆医科大学附属第一医院),其中3例有HBV感染史;5例来自重庆医科大学健康志愿者(男性3例,女性2例,年龄为(28±3)岁)。

  2.2.2  血浆样本采集  按照HPPP推荐的方法采集处理枸橼酸血浆样本[9]。健康志愿者混合血浆由采集的5例健康志愿者枸橼酸血浆混匀后处理。冻存血浆复融后立刻进行后续操作,避免反复冻融。

  2.2.3  免疫亲和色谱去除血浆高丰度蛋白  首先按Agilent MARS柱说明书[10]去除健康志愿者混合血浆高丰度蛋白,并按Bradford蛋白定量方法[11]对MARS柱流出部分(低丰度蛋白质组)、MARS柱结合部分(高丰度蛋白质组)和未经MARS柱处理的原血浆进行蛋白定量。进一步用4%~12%梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS²PAGE)验证MARS柱去除人血浆高丰度蛋白的效果。分别处理5例HCC患者血浆。

  2.2.4  血浆低丰度蛋白反相色谱分级和差异峰收集  移取适量血浆低丰度蛋白组溶液,加入高纯固体尿素涡旋溶解(尿素最终浓度为6 mol/L);然后按1.0%(V/V)加入高纯TFA混匀,得到蛋白浓度为250 mg/L的用于反相色谱分级的低丰度蛋白样品。
   
  优化的色谱分离条件为:ZORBAX 300SB²C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相A为 0.1%(V/V)TFA²水溶液;流动相B为 0.08%(V/V)TFA²乙腈溶液;检测波长:280 nm;定量环:20 μL;流动相流速:0.75 mL/min;柱温:25 ℃。梯度洗脱条件:起始流动相为10%(V/V)B,10 min时B线性增加到50%(V/V),60 min时B线性增加到100%(V/V)并保持20 min直至分析结束。连续运行之间需至少运行两个空白梯度,进样前以10%(V/V)B平衡20 min。
       
  手动收集色谱峰延迟时间的确定。先以延迟体积与流动相流速之比计算大约时间,再以胭脂红实验确定。本实验所用的岛津高效液相色谱仪延迟体积为36.5 μL;流速为0.75 mL/min,计算得延迟时间为2.92 s。分析1 g/L胭脂红标准品,色谱条件为:色谱柱ZORBAX 300SB²C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱温:25 ℃;检测波长:245 nm;定量环:20 μL;流动相流速:0.75 mL/min;流动相:V(甲醇)∶V(0.02 mol/L乙酸铵溶液)=10∶90;以起峰3 s开始收集,落峰3 s停止收集胭脂红色谱峰。以同样的条件分析收集到的胭脂红溶液,前后两次胭脂红色谱峰保留时间分别为8.50和8.51 min。表明手动收集色谱峰延迟时间为3 s时能准确收集到所需要的色谱峰。
   
  分别分析健康志愿者混合血浆低丰度蛋白样品和5例HCC患者血浆低丰度蛋白样品,手动收集差异峰(起峰3 s开始收集,落峰3 s停止收集),冻干,胰酶酶解,-70 ℃冻存。

  2.2.5  HPLC²Chip/MS分析  酶解肽混合物采用HPLC²Chip(Agilent 1100 Series HPLC systems)富集、分级,CHIP包含一支 Zorbax 300SB²C18富集柱(5 mm × 300 μm,5 μm)和一支Zorbax 300SB²C18分离柱(43 mm×75 μm,3.5 μm)。0.008 mL样品进样到富集柱,经富集柱等度洗脱、分离柱梯度洗脱后在线进行MS和MS/MS分析。富集柱等度洗脱条件:流动相为0.1%(V/V)甲酸²超纯水溶液,流速:4 μL/min;分离柱梯度洗脱条件:流动相A为0.1%(V/V)甲酸²超纯水溶液; 流动相B为0.1%(V/V)甲酸²乙腈溶液。起始流动相为3%(V/V)B,保持2 min; 17 min时流动相B为55%(V/V),20 min时B为75%(V/V),保持5 min。流速:0.3 μL/min。以Chip cube作为离子源,毛细管电压2000 V,干燥气流速0.32 L/min,干燥气温度325 ℃,质量扫描范围m/z:300~1500 Da。
   
  Spectrum Mill MS Proteomics Workbench(Rev A.03.03.078)自动分析MS和MS/MS数据,搜索UniProtKB/SWISS²PORT, Homo Sapiens(Human)数据库。数据库搜索参数设置:Trypsin(胰蛋白酶),Monoisotopic Mass values(单同位素质量),Peptide tol.(母离子质量允差)±2.5 Da,MS/MS tol.(MS/MS质量允差)±0.7 Da,Carbamidometholation(C)修饰。搜索后自动以下列条件进行有效性验证:蛋白评分大于11.0;肽评分大于6.0;SPI(structure predictability index for protein sequences)大于60%。

  3  结果与讨论

  3.1  免疫亲和色谱去除人血浆高丰度蛋白
   
  血浆蛋白质含量动态范围非常广、成分极其复杂,具有重要病理学意义和临床诊断价值的蛋白质[3]含量往往在μg/L~sub²μg/L水平,无论对血浆蛋白质组的分级分离还是蛋白表达谱的分析,高丰度蛋白会掩盖很多中、低丰度蛋白的特性并干扰低丰度蛋白检测。因此,需要有效地去除样品中高丰度蛋白。
   
  免疫亲和色谱是以针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性地去除血浆中高丰度蛋白的技术。尽管也有研究表明它可能非特异性地去除了部分有价值的低丰度蛋白[12],但相对于其它去除血浆高丰度蛋白的方法,其特异性高、有效性高和重复性好,因而得到了研究者的普遍认可[13]。其中,Agilent MARS免疫亲和色谱柱能有效去除血浆中6种主要高丰度蛋白(白蛋白、结合珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、转铁蛋白、α²1²抗胰蛋白酶),曾在HUPO PPP项目中广泛使用。
      
  对健康志愿者混合血浆和5例HCC患者血浆,MARS柱结合的高丰度蛋白和流出的低丰度蛋白Bradford法定量结果(见表1)表明, MARS柱有效去除了血浆高丰度蛋白,去除率为85%,重复性好。梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS²PAGE)图中(见图1),泳道7、8是MARS免疫亲和色谱柱特异结合部分,可见6种主要高丰度蛋白被特异有效地结合;泳道4、5、6是MARS免疫亲和色谱柱流出部分,可见高丰度蛋白含量大大减少,更多的中、低丰度蛋白得以呈现。

  表1  Bradford法蛋白定量结果(略)

  图1  健康志愿者混合血浆及其经Agilent MARS柱处理后低丰度蛋白组、高丰度蛋白组的4%~12% SDS²PAGE。泳道2、3是健康志愿者混合原血浆;泳道4、5、6是MARS柱流出部分(低丰度蛋白质组);泳道7、8是MARS柱特异结合部分(高丰度蛋白质组);泳道1是Bio²Rad分子量标准(略)

  3.2  血浆低丰度蛋白质组的反相色谱分级
   
  经Agilent MARS柱处理去除6种主要高丰度蛋白,可以使血浆蛋白质减少80%以上的质量,但得到的低丰度蛋白质组中的蛋白质仍然十分复杂[12],还需进一步分级。考虑到疏水性蛋白质在生物标志物鉴别中有重要意义[14],本研究以反相色谱进行分级。
   
  先后考察了蛋白质的上样量、梯度洗脱程序、改性剂TFA在两相中的浓度和柱后冲洗程序等蛋白质或肽反相色谱分级的关键因素。结果表明,本实验选用的蛋白上样量和色谱条件较好地改善了分离效果,提高了分辨率,重复性好,而且避免了连续运行带来的残留。图2是健康志愿者混合血浆低丰度蛋白质组的反相分级色谱图。图3为健康志愿者混合血浆与5例HCC患者血浆低丰度蛋白质组反相色谱分级色谱图叠加后差异峰放大谱图。图3显示,与健康志愿者混合血浆低丰度蛋白质组的分级结果比较,HCC患者血浆低丰度蛋白质组中有共同高表达的色谱差异峰B,共同低表达差异峰C;1#HCC患者血浆低丰度蛋白质组中特有高表达色谱峰A。 

  图2  健康志愿者混合血浆低丰度蛋白组的反相色谱分级色谱图(略)

  图3  5例HCC患者血浆和健康志愿者混合血浆低丰度蛋白组RP²HPLC分级差异蛋白色谱峰叠加放大色谱图(略)

  A. 1# HCC样品特有高表达蛋白差异色谱峰(differential peak of overexpression proteins in 1# HCC sample); B. 1#~5# HCC样品共同高表达蛋白差异色谱峰(differential peaks of overexpression proteins in 1#-5# HCC samples); C. 1#~5# HCC共同低表达蛋白差异色谱峰(differential peaks of low expression proteins in 1#-5# HCC samples).

  3.3  多维色谱²质谱/质谱分离与分析
   
  二维纳流液相色谱芯片²离子阱质谱系统是将反相富集色谱柱、反相分析色谱柱、液压连接以及电喷雾发射体集成到一个聚合物芯片上的用于纳流电喷雾 LC/MS 的微流控装置。与传统的液相色谱质谱相比,在一块芯片上可以在线完成对酶解肽混合物的富集、反相色谱分离和分离后各成分的离子化,最后以线性离子阱质谱进行MS和MS/MS分析。该系统所需样品量很少、死体积大大减小,适应极少量样品的分离分析,显著提高鉴定蛋白质的能力[15,16]。
   
  分别对1# HCC患者血浆低丰度蛋白质组中共同高表达色谱差异峰B、特有高表达色谱峰A进行了进一步的多维色谱²质谱/质谱分离与分析,结果列于表2。从色谱峰B鉴定出7种蛋白质,从色谱峰A鉴定出20种蛋白质。经过相关文献检索,除Collagen alpha²2(VI) chain (COL6A2)、Collagen alpha²1(XXII) chain (COL22A1)、Uncharacterized protein C12orf65( C12orf65)、Isocitrate dehydrogenase subunit beta[mitochondrial precursor](IDH3B)之外的23种蛋白与各种疾病或肿瘤相关,其中编码Glutamate receptor²interacting protein 1(GRIP1)和Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2(ARNT2)蛋白的基因在人类全长蛋白编码开放阅读框(ORF)标注数据库/疾病基因分类数据库中被公认是与HCC相关致病基因,二者生物学功能文献报道较少。而IMP3是胰岛素样生长因子²Ⅱ mRNA结合蛋白(insulin²like growth factor²Ⅱ mRNA²binding protein, IMP)家族成员,在正常成人组织中检测不到,被认为是一个癌胚蛋白质[17,18]。Himoto等研究表明,抗IMPs的自身抗体可能是诊断AFP阴性结肠癌的血清学补充标志物或预测HCC的标志物[19]。提示ARNT2、GRIP1、IMP3可能成为诊断HCC潜在的生物标志物。这些结果优于以双相电泳技术结合MALDI²TOF²MS的研究结果[20]。
   
  血浆高丰度蛋白的免疫亲和色谱去除和血浆低丰度蛋白的色谱预分级,不仅使血浆低丰度蛋白的上样量得到很大改善,而且能明显降低电喷雾时的离子抑制效应,从而使质谱鉴定信号得到加强,增大了蛋白质鉴定的可能性[21]。图4即为例证之一。图4A为鉴定1# HCC患者血浆低丰度蛋白组反相色谱分级差异峰A中芳香烃受体核转位蛋白2(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2,ARNT2)时,在MS谱中提取的一个三电荷的特征肽母离子萃取离子色谱图(MH+: 1260.3854, m/z 420.8),该图反映通过HPLC²CHIP的富集和分离,产生了很强的质谱信号;图4B为该特征肽母离子的MS/MS谱图。由于母离子信号加强,所以其MS/MS谱中含有丰富的b/y系列的子离子信息,从而提高了序列鉴定能力,最终确认的序列为QSGEQHSHQQP。

  表2  1# HCC患者血浆低丰度蛋白组反相色谱分级差异峰A、差异峰B中鉴定的蛋白质(略)

  注(note): A、B为1# HCC过表达蛋白差异色谱峰(A and B are 1# HCC overerpressed proteins differential peaks).

  图4  差异峰A胰酶酶解肽混合物MS谱中提取的母离子(m/z 420.8)的EIC(A)与该离子的MS/MS谱(B)(略)

  4  结论
   
  本研究建立了免疫亲和色谱去除血浆高丰度蛋白,合并采用反相色谱对血浆低丰度蛋白质组预分级,再以HPLC²CHIP微芯片技术进一步富集、分离酶解肽混合物后,以线性离子阱质谱鉴定HCC患者血浆中差异表达蛋白的策略,结果大大增强质谱信号,鉴定得到27种差异蛋白,其中IMP3、ARNT2和GRIP1等蛋白可能为诊断HCC的潜在生物标志物。研究工作为从血浆/血清中发现疾病生物标志物建立了一种新的临床蛋白质组学多维分析方法。

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作者: 未知 2009-8-1
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