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龙川草骨痛颗粒质量标准的研究

来源:《时珍国医国药》
摘要:【摘要】目的制定龙川草骨痛颗粒质量控制标准。方法采用薄层色谱法对处方中乳香、没药、延胡索、牛膝、桂枝进行定性鉴别。采用高效液相色谱法对绿原酸进行含量测定,用以控制其质量。【关键词】龙川草骨痛颗粒。...

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  【摘要】  目的制定龙川草骨痛颗粒质量控制标准。方法采用薄层色谱法对处方中乳香、没药、延胡索、牛膝、桂枝进行定性鉴别;采用高效液相色谱法对绿原酸进行含量测定,用以控制其质量。结果 HPLC法测定绿原酸可达基线分离,在浓度 1.62~21.60 μg时线性良好,回归方程: A=2 516 409C-2 979,r=1.000 0,5次测定平均加样回收率为98.7%,RSD为2.29%。结论 该法可准确地进行定性、定量检测,能有效地控制该制剂的质量。

  【关键词】  龙川草骨痛颗粒; 薄层色谱法; 高效液相色谱法; 绿原酸

  Study on Quality Standard of Longchuancaogutong Granule

  ZHAO Xin, ZHANG Guangchun,LIU Guiying

  (Institute for Drug and Instrument Control of Shenyang Military Region, Shenyang  110026 ,China; Liaoning Institute for Drug Contral, Shenyang 110016, China)

  Abstract:ObjectiveTo establish a standard for the quality control of Longchuancaogutong Granule.MethodsRamulus Cinnamomi, Radix Achyranthis Bidentatae, Ru Xiang,Mo Yao and Rhizoma Corydalis were identified by TLC,and the control of Chlorogenic acid in Cortex Eucommiae was determined by HPLC. ResultsThe calibration curve was linear in the range of 1.62~21.60 μg(r =1.0000).The average recovery of the method was 98.7%,RSD was 2.29%(n =5). ConclusionThis method is reliable and accurate, and can be used for the quality control  of this preparation.

  Key words:Longchuancaogutong Granule;   TLC;   HPLC;   Chlorogenic acid

  龙川草骨痛颗粒是由杜仲、乳香、没药、延胡索、牛膝、桂枝等15味药材组成的复方制剂。具有补益肝肾、舒筋活络、养血敛阴、止痛消淤等功能,临床上用于治疗腰间盘突出、骨质增生、颈椎病、风湿以及类风湿症,疗效满意。处方中杜仲药材所含的主要成分为绿原酸,绿原酸的含量测定方法,文献报道有薄层扫描法[1]、紫外分光光度法[2]、高效液相色谱法[3]等。本实验采用薄层色谱法对处方中桂枝、牛膝等五味药材进行定性鉴别;采用了检测灵敏度高、准确度及精密度好的高效液相色谱法,对处方中的绿原酸进行含量测定,用以控制其质量。

  1  仪器与试药

  1.1   仪器 LC4A高效液相色谱仪;SPD2A紫外检测器;CR3A积分仪; UV260紫外分光光度计(日本岛津制作所)。

  1.2   试剂与药品  甲醇为色谱纯;磷酸、石油醚、醋酸乙酯、氯仿、正己烷等其它试剂均为分析纯。绿原酸对照品(批号7539406  中国药品生物制品检定所)。龙川草骨痛颗粒(由沈阳军区沈阳制剂中心提供,批号20010612,20020620,20020623,20030314)。

  2  方法与结果

  2.1  鉴别

  2.1.1  桂枝定性鉴别桂枝其有效成分为脂溶性和水溶性两部分,用蒸馏法提取挥发油,以桂皮醛作对照品,参考桂枝薄层色谱鉴别项下的色谱条件进行薄层鉴别,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的橙红色斑点,分离效果好,经阴性对照,阴性样品无干扰,证明此方法具专属性与可行性。

  对照品溶液制备:取桂皮醛对照品,加乙醇制成每毫升含1 μl的溶液,作为对照品溶液。

  阴性对照液制备:取去桂枝的本品细粉5 g ,加乙醇10 ml ,浸泡20 min,时时振摇,滤过,滤液作为阴性对照液溶液。

  供试品溶液制备:取本品细粉5 g ,加乙醇20 ml ,加热回流40 min,滤过,滤液加入盐酸2 ml,加热回流1 h,后浓缩至约5 ml,加水10 ml,用石油醚(60~90℃)20 ml提取,提取液蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。

  测定法:照薄层色谱法[4],吸取供试品溶液、阴性对照液各10 μl、对照品溶液2 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)∶醋酸乙酯(17∶3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以二硝基苯肼试液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的橙黄色斑点。见图1。

  2.1.2  牛膝定性鉴别牛膝含皂苷和脱皮甾酮、牛膝甾酮、钾盐和黏液质等。有散淤活血、消肿痛、补肝肾、强筋骨、降血压等效用。其有效成分三匝皂苷,水解后皂元齐墩果酸,以齐墩果酸为对照品。使用乙醇,加热回流提取并在盐酸条件下,加热回流将提取物水解,用甲醇制成供试品液,另使用氯仿∶甲醇(40∶1)为展开剂。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,分离效果好,经阴性对照,阴性样品无干扰,证明此方法具专属性与可行性。

  对照品溶液制备:取齐墩果酸对照品,加甲醇制成每毫升含1  mg的溶液,作为对照品溶液。

  阴性对照液制备:取去牛膝的本品细粉5 g ,按供试品制备方法,依法操作,作为阴性对照液溶液。

  供试品溶液制备:取本品细粉5 g ,加乙醇20 ml ,加热回流40 min,滤过,滤液加入盐酸2 ml,加热回流1 h,后浓缩至约5 ml,加水10 ml,用石油醚(60~90℃)20 ml提取,提取液蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。

  测定法:照薄层色谱法[4],吸取供试品溶液10~15    μl、对照品溶液2 μl,分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上,以氯仿:甲醇(40∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以磷钼酸试液,在110℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝色斑点。见图2。

  2.1.3  乳香定性鉴别乳香中含树脂、树胶、挥发油。树脂的主要成分为游离α、β-乳香脂酸、结合乳香脂酸、乳香树脂烃;树胶含阿糖酸、西黄芪胶粘素;挥发油呈淡黄色,有芳香,含蒎烯、消旋柠檬烯及α、β-水芹烯。采用水蒸气蒸馏收集挥发油,以药材作对照,以石油醚(60~90℃):醋酸乙酯(85∶5)为展开剂,进行二次展开,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,分离效果好,经阴性对照,阴性样品无干扰,证明此方法具专属性与可行性。

  对照品溶液制备:取乳香对照药材0.5 g,加乙醇10 ml,超声处理5 min,滤过,滤液作为对照品溶液。

  阴性对照液制备:取去乳香的本品细粉5 g ,按供试品制备方法,依法操作,作为阴性对照液溶液。

  供试品溶液制备:取本品细粉10 g ,加乙醇10 ml ,超声处理5 min,滤过,滤液作为供试品溶液。

  测定法:照薄层色谱法[4],吸取供试品溶液10~15 μl、对照品溶液2 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)∶醋酸乙酯(85∶5)为展开剂,展开3 cm,取出,晾干,再以石油醚(60~90℃):醋酸乙酯(85∶5)为展开剂,展开,取出,晾干,以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。见图3。

  图1  桂枝的薄层色谱图 (略)

  图2  牛膝的薄层色谱图 (略)

  图3  乳香的薄层色谱图(略)

  2.1.4  没药定性鉴别   没药中含树脂、树胶、挥发油。树脂的主要成分大部分为脂溶性,小部分为水溶性,含α,β-罕没药酸,没药尼酸,α,β-罕没药酚;挥发油在空气中易树脂化,含丁香油酚、枯醛、蒎烯、桂皮醛等;树胶水解得阿拉伯糖、半乳糖和木糖。采用水蒸气蒸馏收集挥发油,以药材作对照,以石油醚(60~90℃)∶醋酸乙酯(85∶5)为展开剂,进行二次展开,供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,分离效果好,经阴性对照,阴性样品无干扰,证明此方法具专属性与可行性。

  对照品溶液制备:取没药对照药材0.5 g,加乙醇10 ml,超声处理5 min,滤过,滤液作为对照品溶液。

  阴性对照液制备:取去没药的本品细粉5 g ,按供试品制备方法,依法操作,作为阴性对照液溶液。

  供试品溶液制备:取本品细粉10 g ,加乙醇10 ml ,超声处理5 min,滤过,滤液作为供试品溶液。

  测定法:照薄层色谱法[4],吸取供试品溶液10~15 μl、对照品溶液2 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃):醋酸乙酯(85∶5)为展开剂,展开3 cm,取出,晾干,再以石油醚(60~90℃):醋酸乙酯(85∶5)为展开剂,展开,取出,晾干,以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,见图4。

  2.1.5  延胡索薄层色谱鉴别延胡索主要含生物碱,有延胡索甲素、乙素、丙素、丑素等。药理实验已证明,均有显著的镇痛、安定作用。有行气活血、散淤止痛之功效。用于心腹腰膝诸痛、跌打损伤、淤血作痛等症。以延胡索药材为对照,使用氯仿提取,用甲醇制成供试品液,另使用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板,以正己烷∶氯仿∶甲醇(7.5∶4∶1)为展开剂。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,分离效果好,经阴性对照,阴性样品无干扰,证明此方法具专属性与可行性。

  对照品溶液制备:取延胡索对照药材0.5 g,按供试品制备方法,依法操作,作为对照品溶液。

  阴性对照液制备:取去延胡索的本品细粉5 g ,按供试品制备方法,依法操作,作为阴性对照液溶液。

  供试品溶液制备:取本品细粉5 g ,加氯仿30 ml ,浓氨试液1ml,超声处理30 min,滤过,用硫酸(3→10)提取2次,15 ml/次,合并酸提取液,用浓氨试液调pH 9~10滤液作为供试品溶液。用氯仿提取2次,10 ml/次,合并氯仿提取液,蒸干,残渣加甲醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。

  测定法:照薄层色谱法[4],吸取供试品溶液10~15    μl、对照药材溶液2 μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以正己烷∶氯仿∶甲醇(7.5∶4∶1)为展开剂,置已用展开剂饱和的层析缸内,展开,取出,晾干,以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。在空气中挥尽板上吸附的碘后,置紫外光灯(365 nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,见图5。

  图4  没药的薄层色谱图(略)

  图5  延胡索的薄层色谱图(略)

  2.2  龙川草骨痛颗粒中杜仲所含绿原酸的含量测定

  2.2.1  色谱分析条件

  测定波长选择:取绿原酸对照品,加50%甲醇溶解,制成每毫升含10 μg的溶液,紫外分光光度法扫描,光谱见图6。从图6中看出绿原酸在321 nm处有最大吸收,故选择321 nm为测定波长。

  图6  绿原酸对照品UV图谱 (略)

  色谱柱 :十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18柱(4.6    mm×250 mm,7 μm);流速1 ml/min; 柱温28℃; 进样量20 μl 。

  流动相的选择:参照有关文献,选择甲醇-0.4%磷酸溶液(15∶85)为流动相,保留时间约为17 min。

  对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品5 mg(实际称样为5.4 mg),置100 ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声波处理10 min,使对照品溶解,再加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液(54 μg/ml)。

  供试品溶液的制备:取本品装量差异项下的粉末约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入氯仿液30 ml,超声处理2次,30 min/次,弃去氯仿液,挥干,加甲醇30 ml,超声处理2次,30 min/次,合并甲醇液,蒸干,残渣加50%甲醇溶解,转移至10 ml量瓶内,加50%甲醇至刻度,摇匀,即得。

  2.2.2   方法学考察

  空白实验 :按处方量制备缺杜仲的阴性对照溶液,照文中所述含量测定方法操作,结果空白溶液与绿原酸对照品相同保留时间处,未显示明显色谱峰,认为无干扰,见图7。

  图7  龙川草骨痛颗粒的HPLC图(略)

  样品溶液稳定性实验:将待测样品溶液,置室温下贮存,分别于0,0.5,1,2,3,5 h,定期测定含量。结果6次含量的RSD为0.48%,表明样品溶液基本稳定。

  仪器的精密度实验:精密吸取上述对照品溶液(54 μg/ml)20 μl,重复进样6次,结果RSD为0.41% ,精密度实验符合要求。

  重复性实验:取同一批号的供试品,分别进行供试品溶液的制备、测定,重复5次,结果RSD为1.34%。

  线性关系的考察:精密量取绿原酸对照品溶液0.30,0.50,1.00,1.50,2.00和4.00 ml,分别置于10 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀。取20 μl注入液相色谱仪中,记录色谱图,以峰面积为纵坐标,相应浓度为横坐标,进行线性回归,线性方程:A=251 640 9C-2 979,r=1.000 0。

  加样回收率实验:精密称取已知含量的同一批龙川草骨痛颗粒(20010612)1g,精确加入绿原酸对照品适量,按文中供试品溶液的制备方法操作,测定其含量,并计算回收率。结果见表1。

  表1  加样回收率实验(略)

  2.2.3  样品测定 取本品装量差异项下的粉末约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入氯仿液30 ml,超声处理2次,30 min/次,弃去氯仿液,挥干,加甲醇30 ml,超声处理2次,30 min/次,合并甲醇液,蒸干,残渣加50%甲醇溶解,转移至10 ml量瓶内,加50%甲醇至刻度,摇匀,即得。精密称取绿原酸对照品5 mg,置100 ml量瓶中,加50%甲醇适量,超声波处理10 min,使对照品溶解,再加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得。

  本品每袋含杜仲以绿原酸(C16H18O9)计,不得少于1 mg。

  取本品样品3批,按上法测定。结果见表2。

  表2  龙川草骨痛颗粒样品测定结果(略)

  3  讨论

  3.1   提取方法、提取溶剂的选择  分别选用甲醇、乙醇为提取溶剂,超声波处理30 min,结果甲醇提取量大于乙醇。因此选择甲醇为提取溶剂。

  3.2   色谱条件的选择   在本项实验中,我们参考文献,采用了甲醇与磷酸水的配比,而没有采用缓冲液作为流动相,有利于色谱柱的长期使用。

  【参考文献】

  [1] 周庆华,李彦冰,宋恒华.树条荚荆果实中绿原酸的含量测定[J].中医药学报,1996,6:45.

  [2] 丁青龙,黄晓瑾,沈晓洁,等.不同厂家银黄口服液中黄芩苷、绿原酸含量测定[J].中国医院药学杂志,1996,16(7):315.

  [3] 陈金霞,谷 玲,孙立新,等.高效液相色谱法测定小儿咳喘灵口服液中绿原酸的含量[J].现代应用药学,1996,13(4):42.

  [4] 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2005:附录VIB.

 

作者: 佚名 2009-8-13
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