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【摘要】 目的建立归芪生血颗粒（黄芪、枸杞子、火麻仁、当归、五味子等）质量标准。方法采用薄层色谱法对颗粒中的黄芪、枸杞子、火麻仁、当归、五味子进行了定性鉴别；采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）测定了制剂中黄芪甲苷的含量。结果薄层斑点清晰，黄芪甲苷在0.500 1～10.002 μg范围内呈良好的线性关系，平均回收率为98.83%，RSD=1.13 %。结论方法简便，准确，可供本品质量控制。
【关键词】 归芪生血颗粒； 薄层色谱； 高效液相色谱-蒸发光散射检测器； 黄芪甲苷
Study on Quality Standard for Guiqishengxue Granules
PENG Tao，YU Jiawen, QIN Shaorong
(Fuling Pharmaceticals Co. Ltd. of Taiji Group, Chongqing 408000, China)
Abstract：ObjectiveTo establish the quality control standard of Guiqishengxue Granules(Radix Astragali, Fructus Lycii, Fructus Cannabis, Radix Angelicae Sinenis, Fructus Schisandra-e, etc.). Methods Radix Astragali, Fructus Lycii, Fructus Cannabis, Radix Angelicae Si-nenis, Fructus Schisandrae were identified by TLC. The content of Astragaloside IV was determined by HPLC-ELSD. ResultsThe TLC spots developed was fairly clear. The Astragaloside IV showed good linear relationship at a range of 0.500 1～10.002 μg. The average recovery was 98.83% with RSD was 1.13%. ConclusionThe method is simple, accurate and can be applied to the control of the products effectively.
Key words：Guiqishengxue Granules; TLC; HPLC-ELSD; Astragaloside IV
归芪生血颗粒主要由黄芪、枸杞子、生地、天冬、火麻仁、当归、桃仁、红花、五味子等9味中药组成。具有健脾益肾，调畅气血的作用，适用于脾肾不足、气血亏虚、肌肤失养所致颜面皮肤干黄，弹性降低，皮肤松弛等症。为了有效控制药物质量，对归芪生血颗粒中黄芪、枸杞子、火麻仁、当归、五味子进行定性研究，采用HPLC－ELSD法对黄芪的主要成分黄芪甲苷进行含量测定，以期更好地控制该药物的质量。
1 仪器与试药
仪器：岛津LC-10AT，7725i定量进样阀，岛津C-R7Ae型数字处理机，法国SEDEX 55型蒸发光散射检测器（ELSD）；对照品黄芪甲苷（含量测定用），枸杞、火麻仁、当归、五味子对照药材（以上对照品和对照药材均购于中国药品生物制品检定所）；使用的化学试剂均为分析纯，硅胶G（青岛海洋化工厂），自制硅胶板（10 cm×10 cm×0.6 mm）；试验样品归芪生血颗粒（自制）；阴性样品依处方除去被检药材按制备工艺制成。
2 方法与结果
2.1 定性鉴别
2.1.1 黄芪的鉴别取本品20 g，研细，加温水50 ml使溶解，放冷，离心，取上清液，加乙醚提取3次，20 ml/次，合并乙醚液，另器收集；挥尽水层中乙醚，加水饱和的正丁醇提取3次，20 ml/次，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的1%NaOH溶液洗涤3次，20 ml/次，再用正丁醇饱和的水洗涤3次，30 ml/次，正丁醇提取液置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芪阴性样品20 g，同法制成阴性对照溶液。再取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl,对照品溶液5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水（10∶20∶11∶5）10℃下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照样品在相应位置无此斑点。见图1。
2.1.2 枸杞子的鉴别取本品10 g，研细，加热水50 ml使溶解，放冷，离心，取上清液用醋酸乙酯40 ml振摇提取，提取液浓缩至约1.5 ml，作为供试品溶液。另取枸杞子阴性样品，同法制成阴性对照溶液。再取枸杞子对照药材0.5 g，加水35 ml，煮沸15 min，放冷，滤过，滤液用醋酸乙酯15 ml振摇提取，提取液浓缩至约1 ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸（3∶2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照样品在相应位置无此斑点。见图2。
图1 黄芪的鉴别（略）
图2 枸杞子的鉴别（略）
2.1.3 火麻仁的鉴别取火麻仁对照药材0.5 g，加醋酸乙酯20ml，超声提取30 min，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯1 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB试验，吸取定性分析2.2项下供试品溶液20 μl，对照药材溶液、阴性对照溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF-254薄层板上，以环己烷-丙酮（23∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照样品在相应位置无此斑点。见图3。
2.1.4 当归的鉴别取定性分析2.1项下另器收集的乙醚液，自然挥干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取当归阴性样品，同法制成阴性对照溶液。再取当归对照药材1 g，加乙醚20 ml，超声提取15 min，滤过，滤液自然挥干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照样品在相应位置无此斑点。见图4。
2.1.5 五味子的鉴别 取本品20 g，加氯仿100 ml，回流提取1.5 h，滤过，滤液浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。另取五味子阴性样品20 g，同法制成阴性对照溶液。再取五味子对照药材0.5 g，加氯仿100 ml，回流提取1.5h，滤过，滤液浓缩至约1 ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》2005年版Ⅰ部附录VIB试验，吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照药材溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶GF-254薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照样品在相应位置无此斑点。见图5。
图3 火麻仁的鉴别（略）
图4 当归的鉴别（略）
图5 五味子的鉴别（略）
2.2 定量分析
2.2.1 色谱条件美国Phenomenex公司LUNA 5u C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相采用甲醇-水（75∶25），流速为1.0 ml/min，ELSD检测器漂移管温度为40℃，载气（氮气）流速为2.0bar。
2.2.2 溶液的制备精密称定黄芪甲苷对照品适量（由中国生物制品鉴定所提供，批号0781-9908），加甲醇配制成浓度为0.5001 mg/ml的对照品溶液。
供试品溶液的制备:取本品约5 g,精密称定，加水50 ml，溶解，离心，滤过，滤液置分液漏斗中，用氯仿-正丁醇（2∶1）提取4次，第1次50 ml，其余3次30 ml/次（若出现乳化现象，将乳化层离心处理，取下层清液），合并提取液，蒸干，残渣加2%氢氧化钾的甲醇溶液20 ml，并转移至锥形瓶中，水浴回流1 h，提取液蒸干，残渣加水20 ml溶解，移至分液漏斗中，用氯仿-正丁醇（2∶1）提取4次，20 ml/次，合并提取液，蒸干，残渣用甲醇溶液使溶解并转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。
阴性对照品溶液的制备:取按处方比例及制备工艺制备的不含黄芪的阴性样品，照3.3项下操作，同法制成阴性对照溶液。
2.2.3 空白实验将黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液分别注入液相色谱仪，按上述条件进行测定，结果见图6～8。从色谱图可见，样品中的其他成分对黄芪甲苷的测定不会产生干扰。
2.2.4 线性关系与考察 取对照品溶液分别进样1，5，10，15，20 μl，以进样量X（μg）的对数㏒X为横坐标，峰面积Y的对数㏒Y为纵坐标，绘制标准曲线。按照最小二乘法原理进行回归，黄芪甲苷在0.500 1～10.002 μg范围内线性关系良好。回归方程为logY=5.840 9+2.214 4 log X (r=0.999 5)。见图9。
图6 黄芪甲苷对照品的HPLC图谱（略）
图7 归芪生血颗粒样品的HPLC图谱（略）
图8 缺黄芪阴性对照的HPLC图谱（略）
图9 标准曲线（略）
2.2.5 稳定性实验取供试品溶液，分别于0，1，2，3，4 h进样，10 μl/次，记录色谱峰峰面积，结果表明，归芪生血颗粒中黄芪甲苷的含量测定在4 h内稳定，RSD=0.005％（n＝5）。
2.2.6 精密度实验取上述对照品溶液，连续进样5次，10 μl/次，黄芪甲苷峰面积的相对标准偏差分别为0.22%。
2.2.7 重复性实验 取归芪生血颗粒样品（批号000601），精密称取5份，按样品测定方法分别测定其黄芪甲苷的含量， RSD=0.22%（n＝5）。
2.2.8 回收率实验 取归芪生血颗粒（000701批，已测定含量，黄芪甲苷含量为0.100 49 mg/g）6份，精密称定置于具塞锥形瓶中，依次精密加入黄芪甲苷对照品溶液（0.100 6 mg/ml）于上述具塞锥形瓶中，分别加入水50 ml溶解，离心，滤过，滤液置分液漏斗中，用氯仿-正丁醇（2∶1）提取4次，第1次50 ml，其余3次30 ml/次（若出现乳化现象，将乳化层离心处理，取下层清液），合并提取液，蒸干。残渣加2%氢氧化钾的甲醇溶液20 ml，并转移至锥形瓶中，水浴回流1 h，提取液蒸干，残渣加水20 ml溶解，移至分液漏斗中，用氯仿-正丁醇（2∶1）提取4次，20 ml/次，合并提取液，蒸干，残渣用甲醇使溶解并转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经孔径0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，续滤液作为供试品溶液。按照拟定色谱条件，各取10μl注入液相色谱仪，测定，每份测定两次，取平均值，计算回收率，结果见表1。
表1 加样回收率实验（略）
2.2.9 样品测定按照拟定方法，共测定7批样品的黄芪甲苷含量，每批平行两份测定，结果见表2。
表2 归芪生血颗粒中黄芪甲苷含量测定（略）
3 讨论
黄芪甲苷成分紫外吸收较差，最大吸收波长为200.8 nm。如用紫外检测器受试剂影响较大，使分析难以进行，该质量标准目前多采用薄层扫描法进行定量。薄层扫描法的分离效果不理想，背景噪音大，且操作繁琐。ELSD检测器为质量型检测器，不受外部环境干扰，试剂在检测器中全部挥发，不干扰检测，是一种检测黄芪甲苷成分的有效方法［1］。
由于处方中成分复杂，在对样品前处理过程中，发现用5%碳酸钠溶液和氨试液洗涤，所得的杂质较多，黄芪甲苷的含量较低，经比较将5%碳酸钠溶液和氨试液改为用2%氢氧化钾的甲醇溶液来处理氯仿-正丁醇提取物，再用氯仿-正丁醇萃取，测得黄芪甲苷含量明显提高。
本法采用高效液相色谱法快速分离测定黄芪甲苷，与2000年版《中国药典》方法［2］相比结果没有明显差异，但分析时间大大缩短，两种方法测定结果比较见表3。
表3 本法与《中国药典》测定黄芪药材中黄芪甲苷含量比较（略）
通过比较本品规定的黄芪药材含测方法和药典规定的黄芪药材含测方法所测得的结果基本一致。因此能保证本品所用黄芪药材符合药典规定。
【参考文献】
［1］ 王宝琴，苏 健，鲁 静.黄芪甲苷的检测在中药质控中应用［J］.中国中药杂志，1996，21（3）：161.
［2］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：工业出版社，2000：249.