骨炎宁颗粒的质量标准研究

　　【摘要】  目的建立骨炎宁颗粒质量标准。方法采用薄层色谱(TLC)法对处方中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等4种药材进行定性鉴别;采用高效液相色谱(HPLC)法测定骨炎宁颗粒中绿原酸的含量。结果在TLC色谱中均能检出大血藤、天花粉、皂角刺、地榆，骨炎宁颗粒中绿原酸与其它组分良好分离，绿原酸浓度线性范围在0.0025～0.04μg（ r=0.999 9），样品加样回收率为99.60%， RSD=1.07%（n=6）。结论所建立的方法简便可靠，重复性好，为骨炎宁颗粒的质量控制提供了依据。

　　【关键词】  骨炎宁颗粒 绿原酸 薄层色谱 高效液相色谱

　　Study on the Quality Standard for Guyanning Granules

　　L Yi , CHEN Huating,LU Jinqing

　　1.Department of Pharmacy, Union Hospital Affiliated with Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022 China;

　　2.Hubei College of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430061 China

　　Abstract：ObjectiveTo establish a standard for the quality control of Guyanning Granules. MethodsCaulis sargentodoxae, Radix trichosanthis, spina gleditsiae and Radix sanguisorbae  were identified by TLC. While  HPLC was applied for the determination of chlorogenic acid in flos lonicerae in Guyanning Granules. ResultsThe chromatograms of caulis sargentodoxae, Radix trichosanthis, spina gleditsiae and Radix sanguisorbae were obtained through TLC presented the spots of the same colors with those in the corresponding places in the chromatograms of the control articles. There was a good linear relationship within a range of 0.0025～0.04μg of Paeoniflorin ,correlation coefficient r=0.9999,the average recovery was99.60%（n=6）, RSD=1.07%, (n=6). ConclusionThis method is simple ,feasible and reproducible and provides a method for quality control of Guyanning Granules.

　　Key words：Guyanning Granules；   Chlorogenic acid；   TLC；  HPLC

　　骨炎宁颗粒是华中科技大学协和医院经多年研制的纯中药复方制剂，由金银花、赤芍、天花粉、大血藤等多味中药加工制成，具有解热止痛、活血消肿的功效，用于治疗急慢性化脓性骨髓炎、关节炎、脓肿疔痛，疗效显著。本研究建立了TLC对制剂中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定处方中金银花的活性成分绿原酸含量的方法，对控制骨炎宁颗粒质量有重要意义。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器

　　DIONEX-P680高效液相色谱仪， AT-201电子分析天平（d=0.01mg，瑞士），UP5200H超声波清洗机（熊猫集团南京电子计量有限公司）。

　　1.2  试药骨炎宁颗粒（华中科技大学协和医院制剂室提供）；薄层层析硅胶板G型 (青岛海洋化工厂)；绿原酸对照品（批号110753-200413）、大血藤对照药材（批号121353－200401）、瓜氨酸对照品（批号0875－9802）、皂角刺对照药材（批号121210－200501）、没食子酸对照品（批号11083－200302）均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。实验所用中药饮片均购自武汉国药集团中药饮片厂。

　　2  方法与结果

　　2.1  薄层色谱鉴别［1］

　　2.1.1  大血藤取本品研细，取粉末1 g，精密称定，加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加2％氢氧化钠溶液10 ml使溶解，用盐酸调节pH值至2，用乙醚振摇提取3次，10 ml/次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。取阴性样品研细，取粉末1 g，精密称定，加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加2％氢氧化钠溶液10 ml使溶解，用盐酸调节pH值至2，用乙醚振摇提取3次，10 ml/次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为阴性样品溶液。取本品粗粉1 g加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加2％氢氧化钠溶液10 ml使溶解，用盐酸调节pH值至2，用乙醚振摇提取3次，10 ml/次,合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法［2］实验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷丙酮甲酸（8∶1∶0.8）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱在相应的位置上，显相同的颜色的斑点，阴性对照样品则无此斑点。见图1。

　　2.1.2  天花粉

　　取本品研细，取粉末1 g，精密称定，加稀乙醇20 ml,超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。取阴性样品研细，取粉末1 g，精密称定，加稀乙醇20 ml，超声处理30 min，滤过，滤液作为阴性样品溶液。取本品粉末1 g，精密称定，加稀乙醇20 ml，超声处理30 min，滤过，滤液作为对照药材溶液。取瓜氨酸对照品加稀乙醇使溶解，制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）实验，吸取前3种溶液各2 μl及对照品溶液1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇无水乙醇冰醋酸水（7∶2∶2∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照样品则无此斑点。见图2。

　　2.1.3  皂角刺取本品研细，取粉末1.2 g，精密称定，加正丁醇15 ml，水浴加热回流2 h，滤过，滤液于水浴上浓缩至5 ml，作为供试品溶液。取阴性样品研细，取粉末1.2 g，精密称定，加正丁醇15 ml，水浴加热回流2 h，滤过，滤液于水浴上浓缩至5 ml，作为阴性样品溶液。取皂角刺对照药材2.5 g，加入正丁醇50 ml，置水浴上加热回流2 h，滤过，滤液于水浴上浓缩至5 ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）实验，分别吸取3种溶液10 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷醋酸乙酯甲酸（10∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％硫酸乙醇溶液，在紫外灯（365 nm）下检视供试品色谱中，在与对照药材色谱在相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照样品则无此斑点。见图3。

　　2.1.4  地榆取本品研细，取粉末1 g，精密称定，加水20 ml，超声处理20 min，放冷，离心，取上清液，用盐酸饱和的乙醚振摇提取2次，20 ml/次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取阴性样品研细，取粉末1 g，精密称定，加水20 ml，超声处理20 min，放冷，离心，取上清液，用盐酸饱和的乙醚振摇提取2次，20 ml/次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为阴性样品溶液。取本品粉末2 g，加水20 ml,煮沸30 min，放冷，离心10 min，取上清液，用盐酸饱和的乙醚振摇提取2次，15 ml/次,合并乙醚溶液，挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。取没食子酸对照品加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录ⅥB）实验，吸取前3种溶液各3 μl，对照品溶液4 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯（用水饱和）醋酸乙酯甲酸（6∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品则无此斑点。见图4。

　　2.2  绿原酸的含量测定

　　2.2.1  色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈0.4%磷酸水溶液（9∶91）为流动相；检测波长为327 nm；进样量10 μl。理论塔板数按绿原酸计算应不低于5 000。

　　2.2.2  溶液的制备

　　对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品（60℃减压干燥至恒重）适量，加甲醇制成每毫升含2.5 μg的溶液，即得。

　　供试样品的制备：取本品研细，取约1.5 g，精密称定, 置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇50 ml，密塞，放置15 min，摇匀，取续滤液，即得。

　　阴性样品溶液制备：按处方比例和工艺,制成不含绿原酸药材的阴性样品，按以上“供试样品的制备”项下同样的方法制备阴性对照溶液。

　　2.2.3  线性关系考察精密称取经60℃减压干燥至恒重的绿原酸对照品12.5 mg，置50 ml量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1，2，4，8和16 ml，分别置5个100 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（相当于2.5，5，10，20，40 μg/ml）。 照高效液相色谱法［2］，精密量取10 μl注入液相色谱仪，以峰面积积分值为纵坐标，以进样的对照品溶液浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程为：y= 5 386.137 7x + 3.291 2,r=0.999 9。结果表明绿原酸进样量在0.0025～0.04 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。见图5～7。

　　2.2.4  干扰实验按照上述色谱条件，吸取对照品溶液，供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl测定。在供试品色谱图中，与对照品色谱峰相应的位置上有一相同保留时间的色谱峰，而阴性样品溶液在此保留时间无干扰。

　　2.2.5  精密度实验

　　精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样5次，测定对照品溶液峰面积，计算RSD=0.51%（n=5），提示精密度良好。

　　2.2.6  稳定性实验取同一批样品，按上述方法配制供试品溶液，分别于0，3，9，12，24 h注入液相色谱仪中测定，其峰面积基本保持不变，RSD=2.30%，稳定性良好。

　　2.2.7  重现性实验取同一样品5份，每份1.5 g，精密称定，照文前“供试样品的制备”项下的方法制备，按上述色谱条件，测定样品中绿原酸峰面积值并计算含量，RSD=1.29 %（n=5）。表明本方法重现性良好。

　　2.2.8  加样回收率实验 取已知含量的本品粉末6份，每份0.75 g，精密称定，加入一定量的绿原酸对照品，按文前“供试样品的制备”项下的方法制备，按上述色谱条件进行测定，计算回收率为99.60%，RSD=1.07%。结果见表1。表1  绿原酸加样回收率计算结果（略）

　　2.2.9  含量测定

　　取5个批号的样品，称取约1.5 g,每个批次取两份，按含量测定方法分别制备对照品溶液和供试品溶液,精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，按上述色谱条件测定。结果见表2。表2  样品测定结果（略）

　　3  讨论

　　曾经试用过文献［3］报道的甲醇-0.4%磷酸溶液(20∶80), 甲醇11%冰醋酸溶液(10∶90)，乙腈-0.4%磷酸溶液(13∶87) 等流动相,均不能使样品中绿原酸和其他干扰组分峰完全分离。经多次实验,以乙腈、水组合成流动相,水中含0.4%的冰醋酸对样品的分离较好。当两者比例为9∶91时样品中绿原酸不仅与其他干扰峰完全分离,而且保留时间适中(tR=11.40),峰形对称且尖锐,故选择为含量测定的流动相。

　　方法学研究结果表明,采用TLC法对处方中的大血藤、天花粉、皂角刺、地榆等4种药材进行定性鉴别;采用HPLC法对处方中金银花的绿原酸进行了含量测定,结果准确,重复性好,能够有效控制该产品的质量。

　　【参考文献】

　　［1］廉延国.中成药薄层色谱鉴别［M］.北京：人民卫生出版社，1995：161.

　　［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：152，附录ⅥB，Ⅴ.

　　［3］马成俊，李桂生，任召言等.金银花药材对照指纹图谱的建立及质量评价［J］.时珍国医国药,2006，17（2）：238.