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【摘要】 目的: 建立爱福宁合剂质量标准。方法: 采用薄层色谱法鉴别苦参、金荞麦,采用高效液相色谱法测定苦参碱的含量。结果: 薄层斑点清晰,重现性好,含量测定平均回收率为99.35%,RSD为1.52%。结论: 该方法准确,简便,重现性好,可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 苦参碱; 爱福宁合剂; 色谱法, 高压液相; 色谱法,薄层
A Study on Quality Standard of Aifuning Oral Liquid
ZHANG Jue, LIU Lina, LI Yongjun, HE Xun
(School of Pharmacology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China)
[Abstract] Objective: To establish a quality control standard for Ai Funing oral liquid. Methods: Radix Sophorae Flavescentis and Rhizoma Fagopyri Dibotryis were identified with thin-layer Chromatography (TLC) and the content of matrine was determined with high pressure liquid chromatography (HPLC) in the preparation. Results: The TLC developed spots were fairly clear, the HPLC method showed good repeatability, and the average recovery of matrine was 99.35% with RSD 1.52%(n=9). Conclusions: The method is accurate, rapid, sensitive with good reproducibility, which is a an ideal method for quality control of Aifuning oral liquid.
[Key words] sophocarpidine; aifuning oral liquid; chromatography, high pressure liquid; chromatography, thin layer
爱福宁合剂是在贵州苗族民间验方的基础上以刺梨、苦参、金荞麦配伍组方,用现代生物工程技术处理精制而成的新一代抗癌药物[1],具有清热解毒,健脾生津,燥湿和胃之功,临床作为肿瘤治疗的辅助药[2]。苦参作为方中的臣药,是豆科植物Sophora flavescens Ait.的干燥根,主要含苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱、氧化槐果碱、槐花醇等生物碱及黄酮类化合物[3,4]。2005年根据处方中所含药味的化学成分及剂型特点,研究制定了苦参、金荞麦的薄层色谱鉴别及苦参的含量测定方法,用以控制药品质量。
1 材料与方法
1.1 仪器
硅胶G预制板(青岛海洋化工集团),LC-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津),包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外光检测器、Rheodyne7725i进样阀;TC-100柱温箱(天津特纳);N2000色谱数据工作站(浙江大学);UV-2401PC紫外-可见光分光光度计(日本岛津);超声波清洗器(250 W,29~34 kHz;北京医疗设备二厂)。
1.2 试药
甲醇为色谱纯,氯仿、氨水、乙酸乙酯等均为分析纯,水为重蒸水。苦参对照药材(批号1019-200003)、金荞麦对照药材(批号1114-200001)、苦参碱对照品(批号805-200005,供含量测定用)均由中国药品生物制品检定所提供。3批爱福宁合剂由贵州老来福药业有限公司提供。
1.3 定性鉴别
1.3.1 苦参鉴别 取本品10 ml,加浓氨试液调节pH 9~10,用氯仿提取2次,每次10 ml,合并氯仿提取液,蒸干,残渣加氯仿0.5 ml使溶解,作供试品溶液。再取缺苦参药材的阴性样品,同法制得阴性对照液。另取苦参对照药材0.5 g,加氯仿25 ml,浓氨试液0.3 ml,超声处理15 min,滤过,滤液蒸干,残渣加氯仿0.5 ml使溶解,作为对照药材溶液。取苦参碱对照品加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。分别吸取上述4种溶液各5 μl,点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(20∶1∶0.5)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以碘化铋钾试液,置日光下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰。
1.3.2 金荞麦鉴别 取本品30 ml,用饱和碳酸钠溶液调节pH 7,用乙酸乙酯提取2次,每次20 ml,弃去乙酸乙酯液,水层用水饱和的正丁醇提取2次,每次20 ml,合并正丁醇液,置蒸发皿中蒸干,残渣加5%盐酸30 ml使溶解,水浴回流1 h放冷,水解液用乙醚提取2次,每次25 ml,合并乙醚液,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。再取缺金荞麦药材的阴性样品,同法制得阴性对照液。另取金荞麦对照药材3 g,加70%乙醇30 ml回流30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水30 ml使溶解,滤过,滤液用饱和的碳酸钠溶液调pH 7,以下同供试品溶液制备操作,得对照品溶液。分别吸取上述3种溶液各5 μl,点于同一硅胶G薄层板上,以苯-丙酮-甲酸(6∶3∶0.2)为展开剂,展开、取出、晾干。喷以2%三氯化铝乙醇溶液,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性无干扰。
1.4 含量测定
1.4.1 对照品溶液的制备 称取苦参碱对照品适量,用甲醇制成每0.15 g/L的溶液,摇匀即得。
1.4.2 供试品溶液的制备 精密吸取本品10 ml,加入浓氨试液0.5 ml,用氯仿提取4次,每次15 ml,合并氯仿液,浓缩至干,残渣用甲醇溶解,定量转移至5 ml量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。
1.4.3 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱(5.0 mm×500 mm,5 μm,大连依利特科技有限公司);流动相:甲醇-0.05%三乙胺溶液(52∶48),流速1 m/min,温度40 ℃,检测波长220 nm。进样量为10 μl。理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于4 000。
1.4.4 阴性对照实验 取缺苦参阴性制剂,按供试品制备方法制备阴性供试品。按照上述方法测定,阴性供试品溶液无干扰。结果见图1。
1.4.5 线性关系考察 取苦参碱对照品10.7 mg,置25 ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释刻度,摇匀,得对照品储备液。精密吸取苦参碱对照品储备液0.5、1、2、4、8 ml于10 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得对照品系列工作液;分别精密吸取10 μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,以对照品进样量为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归计算,得线性回归方程为Y=368 467X+3 810,γ=0.999 9,苦参碱进样量在0.214~3.424 μg呈良好的线性关系。
1.4.6 精密度试验 取一样品,按1.4.2项下方法制备供试品溶液,进样测定5次,结果苦参碱峰面积的RSD为0.38%。
1.4.7 重复性试验 取同一批号样品5份,按供试品溶液的制备方法制备5份供试液,测定苦参碱平均含量为0.070 5 g/L,RSD为1.12%。
1.4.8 稳定性考察 取同一供试品溶液,分别于0、1、2、4、8 h测定,计算供试品在8 h内峰面积积分,分值前后无明显变化,RSD为1.82%。
1.4.9 回收率试验 取已测定含量的样品(苦参碱含量0.070 5 g/L)5 ml,各9份,分别精密加入苦参碱对照品溶液适量,按供试品溶液的制备方法制备供试液,进样测定,记录色谱图,计算苦参碱回收率,结果见表1。 表1 爱福宁合剂中苦参碱回收率试验
1.4.10 样品测定 分别精密吸取3个批号(20050318、20050420、 20050623)供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,计算样品中苦参碱的含量,结果3批样品中苦参碱含量分别为0.082、0.078、0.069 g/L。
2 讨论
2.1 色谱条件 参考文献[5,6]。选用了Kromasil C18、Hypersil C18、Diamonsil C18色谱柱,采用乙腈-3%磷酸溶液、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05%三乙胺溶液、乙腈-0.05%三乙胺等溶液为流动相系统,结果以甲醇-0.05%三乙胺溶液(52∶48),Kromasil C18 (5.0 mm ×200 mm,5 μm)色谱柱,色谱峰分离最好,峰形对称。
2.2 检测波长的选择 取苦参碱对照品的甲醇溶液,置紫外-可见光分光光度计于190~360 nm进行光谱扫描,从苦参碱的紫外光谱图上可见,苦参碱的最大吸收波长分别为208 nm和204 nm。由于208 nm和204 nm均为紫外末端吸收,在此波长处检测杂质干扰较大,基线不易平稳,按照2005年版药典苦参药材项下规定,选择220 nm为检测波长,基线较好,且杂质对测定无干扰。
制剂中苦参、金荞麦采用薄层色谱法进行定性鉴别,经反复试验,优选其提取方法和展开剂。结果,色谱特征为斑点明显,阴性对照无干扰,专属性强,可用于该制剂的定性鉴别。
【参考文献】
[1]赵新环,谢正富.苗族方药“爱福宁合剂”的抗癌作用[J].中国民族民间医药杂志,2002(57):223-225.
[2]陈声池,沈剑钦,张长其.爱福宁治疗消化道肿瘤疗效观察[J].福建中医学院学报,2002(4):20-21.
[3]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社,2005:141.
[4]徐国钧,何宏贤,徐珞珊.中国药材学[M].北京:中国医药科技出版社,1996:252-256.
[5]苏静州,刘明言, 董海荣. HPLC法测定复方石韦片中苦参碱和氧化苦参碱的含量[J]. 中草药,2005(3):383-384.
[6]马开宇, 刘丛彬. RP-HPLC法测定妇炎康片中苦参碱的含量[J].安徽医药,2005(9):669-670.