点击显示 收起
【摘要】 目的建立同时测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的反相高效液相色谱检测方法。方法采用Restek Pinnacle Ⅱ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，配制流动相为甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4水溶液=42∶13∶56，在流速为1.0 ml/min，检测波长为350 nm，柱温为室温，进样量为10 μl的情况下建立测定方法。结果木犀草素线性范围为3.99～99.75 μg/ml（r=0.999 6），平均加样回收率为105.9%，RSD=1.5%；芹菜素线性范围为4.095～102.375 μg/ml（r=0.999 6），平均加样回收率为103.7%，RSD=2.5%。结论用该方法测定亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量，具有分析时间较短，分离度高的特点。
【关键词】 反相高效液相色谱法；木犀草素；芹菜素；亳菊提取物
Abstract：ObjectiveTo develop a reversed-phase high performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of luteolin and apigenin in Chrysanthemum morifolium extract.MethodsThe separation was carried out on a Restek Pinnacle Ⅱ C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with MeOH∶THF∶0.3%H3PO4=42∶13∶56 as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml/min.The absorbance was monitored at 350 nm.The volume of injection was 10 μl.ResultsThe linearity was good within the ranges of 3.99 μg/ml～99.75 μg/ml（r=0.999 6）for luteolin and 4.095 μg/ml～102.375 μg/ml（r=0.999 6）for apigenin.The average recoveries were 105.9% and 103.7% and the relative standard deviations（RSDs）were 1.5% and 2.5% respectively.ConclusionThe method used for the determination of luteolin and apigenin in the Chrysanthemum morifolium extract has the characteristics of short retention and high resolution.
Key words：RP-HPLC；Luteolin；Apigenin； Chrysanthemum morifolium extract
中药菊花是菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥头状花序［1］，是一种常用中药，具有疏风、清热、明目、解毒功效，临床上用于治疗高血压病和冠心病等［2］。亳菊主产于安徽亳州、涡阳一带［3］。菊花的有效部位主要有黄酮类、萜类、碳环芳香族酚酸类化合物（蒋惠娣．《中药杭白菊心血管系统作用及活性成分研究》．2004浙江大学博士学位论文）［4］。亳菊提取物成分复杂，为控制其产品质量，依据菊花药效物质及药理作用，建议以绿原酸、木犀草素、芹菜素和总黄酮4个指标，构建质量评价体系。其中木犀草素具有消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降低兔实验性动脉粥样硬化程度和降胆固醇等作用［4，5］；芹菜素具有抗肿瘤、抗炎、降血压和舒张血管、抗动脉硬化和血栓症、抗焦虑、抗菌、抗病毒等作用［6］。两者药理作用与亳菊的药理作用相近，且两者在亳菊提取物中含量较高。因此，建立同时测定木犀草素及芹菜素的HPLC测定方法，对亳菊提取物的质量标准研究及亳菊药材的质量控制具有重要的意义。
1 仪器与试药
Waters高效液相系统（包括Waters 515泵，Waters 2487双波长紫外检测器，Empower色谱工作站）；SC5202超声清洗器（上海蒲超超声波仪器设备有限公司）；AG135型电子天平（Mettler Toledo）。
甲醇（色谱纯）；四氢呋喃（色谱纯）；超纯水；磷酸（分析纯）；木犀草素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111520-200504）；芹菜素对照品（上海融禾医药科技发展有限公司）；亳菊［Dendranthema.morifolium(Ramat.)Tzvel.cv.‘Boju’由安徽济人药业提供］；亳菊提取物样品（农产品生物化工教育部工程研究中心研究制备）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为Restek Pinnacle Ⅱ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4=42∶13∶56；流速1.0 ml/min；检测波长350 nm；柱温为室温；进样量10 μl。
2.2 对照品储备液的制备精密称取木犀草素、芹菜素对照品适量，用甲醇溶解配制成含木犀草素为399 μg/ml及芹菜素为409.5 μg/ml的对照品混合溶液。
2.3 供试品溶液的制备取亳菊提取物样品约75 mg，精密称定置小烧杯中，用10 ml甲醇超声溶解，转移至25 ml容量瓶中并定容摇匀，取部分溶液离心（10 000 r/min，5 min），取上清液即得供试品溶液。
2.4 标准曲线的绘制从对照品储备液中精密量取0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml，分别置于10 ml容量瓶中，甲醇定容，得到系列混合对照品溶液，各进样10 μl，按照上述的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，对照品浓度（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，得木犀草素回归方程为Y=34 778X-41 681（r=0.999 6），线性范围为3.99～99.75 μg/ml；芹菜素回归方程为Y=50 871X-38 471（r=0.999 6），线性范围为4.095～102.375 μg/ml。
2.5 精密度实验取木犀草素、芹菜素混合对照品溶液（其中木犀草素为99.75 μg/ml，芹菜素为102.375 μg/ml）重复进样5次，10 μl/次，测量峰面积，其中木犀草素峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.93%，芹菜素峰面积的相对标准偏差（RSD）为2.07%。
2.6 重复性实验按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，分别进样10 μl，依照上述选择的色谱条件测定，结果木犀草素含量的RSD为1.83%，芹菜素含量的RSD为2.08%。
2.7 稳定性实验按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，16 h分别进样10 μl，依照上述选择的色谱条件测定，结果木犀草素峰面积的RSD为2.26%，芹菜素峰面积的RSD为3.03%。
2.8 加样回收率实验
2.8.1 木犀草素加样回收率实验精密称取亳菊提取物约20 mg置小烧杯中，加入木犀草素对照品，用5 ml甲醇超声溶解,转移至10 ml容量瓶中并定容摇匀，取部分溶液离心（10 000 r/min，5 min），取上清液，进样10 μl，依照上述选择的色谱条件测定。结果见表1。表1 亳菊提取物中木犀草素的加样回收率测定结果（略）
2.8.2 芹菜素加样回收率实验精密称取亳菊提取物约75 mg置小烧杯中，加入芹菜素对照品，用10 ml甲醇超声溶解，转移至25 ml容量瓶中并定容摇匀，取部分溶液离心（10 000 r/min，5 min），取上清液，进样10 μl，依照上述选择的色谱条件测定。结果见表2。表2 亳菊提取物中芹菜素的加样回收率测定结果（略）
2.9 样品测定按供试品溶液制备方法制备5份供试品溶液，依照上述选择的色谱条件，进样10 μl，木犀草素和芹菜素的保留时间分别在11.3，15.6 min左右。色谱图见图1。结果见表3。表3 亳菊提取物中木犀草素及芹菜素的含量测定（略）
3 讨论
3.1 检测指标的确定《中华人民共和国药典》菊花项下以绿原酸为质量控制指标，但仅用绿原酸难以反映菊花广泛的药理作用。亳菊中黄酮类化合物含量高,对心血管具有多种作用，所以黄酮类化合物含量宜列入质量控制指标。由于黄酮类成分比较复杂，一般以测总黄酮为考察指标（邢志霞．《怀菊花质量标准研究》．河南中医学院论文集．2006）。有效成分木犀草素及芹菜素是在亳菊中含量较高且药理作用与菊花相似的黄酮类单体成分，其含量的高低对于亳菊药材以及亳菊提取物的药效有着重要影响，所以在亳菊药材及其提取物质量检查时如同时控制绿原酸、总黄酮、木犀草素及芹菜素的含量则更佳。
3.2 流动相的选择文献资料基本是用甲醇磷酸水溶液作为流动相来测定木犀草素，但是在本研究过程中经过多次实验，发现分离效果对于流动相组成比例和温度变化很敏感，且分析时间长。多次实验结果表明，在等梯度的情况下，只用甲醇磷酸水溶液做流动相同时测定木犀草素及芹菜素，难以使两者达到较好检测水平。
流动相加入四氢呋喃后，发现黄酮苷元分离的选择性提高了。根据实验中色谱峰出峰规律，最终将甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4=42∶13∶56作为定量检测用的流动相。该色谱条件分析时间较短，木犀草素及芹菜素均有较佳的分离效果。柱温对分离效果有影响，在柱温为20，25，30℃条件下尝试测定，发现分离效果均较好。20，25，30℃在《中国药典》规定的室温（10～30℃）范围内，所以方法中定柱温为室温。图2为筛选流动相时候的分离效果图。
可以看到流动相为甲醇∶0.2%H3PO4=50∶50时，木犀草素及芹菜素分离效果均不好且时间长；流动相为甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4=44∶7∶56时，芹菜素分离效果较好，而木犀草素峰周围有杂峰干扰； 流动相为甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4=44∶9∶56时，依旧芹菜素分离效果较好，此时与木犀草素相邻的干扰峰随着四氢呋喃量的增加，出峰渐快于木犀草素，继续加大四氢呋喃的量，在流动相为甲醇∶四氢呋喃∶0.3%H3PO4=42∶13∶56时,两者均有较好的分离效果且分析时间减少了。3.3 色谱柱的选择实验尝试运用本工程研究中心的三根十八烷基硅烷 键合硅胶色谱柱：Agilent Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)，Restek Pinnacle DB C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)和Restek Pinnacle ⅡC18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，效果均较好，能达到基线分离，说明此流动相具有一定的通用性。通过比较，认为用Restek Pinnacle ⅡC18(250 mm×4.6 mm,5μm)效果更好。
用本方法可同步测定亳菊提取物中的木犀草素和芹菜素。方法具有分析时间较短，分离度高的特点。木犀草素和芹菜素的保留时间分别在11.3，15.6 min左右；木犀草素线性范围为3.99～99.75 μg/ml（r=0.999 6），平均加样回收率为105.9%，RSD=1.5%；芹菜素线性范围为4.095～102.375 μg/ml（r=0.999 6），平均加样回收率为103.7%，RSD=2.5%。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］．北京：化学工业出版社，2005．
［2］白雁，鲍红娟，王东．不同产地药用菊花红外光谱法的分析与鉴定［J］．中成药，2006，28(12)：1721．
［3］顾瑶华，秦民坚．亳菊的化学成分研究［J］．中草药，2006，37(12)：1784．
［4］程宏英，冯启余，曹玉华．菊花中活性成分的高效液相色谱测定与指纹图谱研究［J］．分析科学学报，2007，23(3)：257．
［5］李星霞，郭澄．木犀草素的药理活性研究［J］．中国药房，2007，18(18)：1421．
［6］孙斌，瞿伟菁，张晓玲．芹菜素的药理作用研究进展［J］．中药材，2004，27(7)：531.
转贴于 中国论文下载中心 http://www.studa.net