高效液相色谱法测定消糖灵胶囊中盐酸小檗碱的含量

　　【摘要】目的建立用高效液相色谱法测定消糖灵胶囊中盐酸小檗碱的含量。方法采用依利特Sino Chrom ODS-BP柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，以乙腈-磷酸二氢钠溶液(28∶72)为流动相，在345 nm波长进行测定。结果盐酸小檗碱在0.08～1.30 mg线性关系良好，平均回收率为98.59%，RSD=2.74%(n=5)，重复进样RSD=1.55% (n=5)。结论该方法简便、快捷、准确，灵敏度高，可以作为该制剂的质量控制方法。

　　【关键词】  消糖灵胶囊 盐酸小檗碱 高效液相色谱法

　　“消糖灵胶囊”标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》，标准编号为WS3-B-2026，是由人参、黄连、黄芪、天花粉、杜仲、枸杞子、五味子等11味中药加优降糖组成的方剂，具有益气养阴、清热泻火、益肾缩尿的功效，可用于治疗糖尿病［1］。本方中黄芪、天花粉为君药；人参、知母、枸杞子为臣药；黄连、白芍、沙苑子、五味子、杜仲、丹参为佐药。其中天花粉、枸杞子采用高效液相法进行含量测定的方法尚不成熟；黄芪和知母需要蒸发光散射检测器［2］测定，而多数生产企业不具备该设备；人参需要在203 nm处梯度洗脱测定［3］，经过实验发现重复性、稳定性差，故对佐药黄连进行含量测定。

　　黄连主要有效成分中小檗碱含量最高。本实验以盐酸小檗碱为标准物质进行含量测定。

　　1  仪器与试药

　　美国惠普HP1100高效液相色谱仪，HP1100色谱工作站；盐酸小檗碱对照品(中国生物制品检定所,批号110713-200208，供含量测定用)。乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件［4，5］

　　色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BP柱(4.6 mm×200 mm，5 μm )； 柱温35 ℃； 流动相为乙腈-磷酸二氢钠溶液(pH=5.0) (28∶72)；流速1.0 ml·min-1；检测波长345 nm。

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  对照品溶液的制备精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每毫升含盐酸小檗碱400 μg的溶液，摇匀，即得对照品溶液。

　　2.2.2  供试品溶液的制备取本品内容物约5 g，研细（过80目筛），精密称取0.5～1.0 g,置50 ml量瓶中，加盐酸-甲醇（1∶100）40 ml，超声处理30 min，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

　　2.2.3  阴性对照液的制备按处方比例配制缺黄连的阴性对照品，同供试品溶液的制备方法制得阴性对照溶液。

　　2.3 系统适用性实验的考察依上述方法，测得盐酸小檗碱对照品、供试品及阴性对照品的色谱图(见图1～3)。结果在该色谱条件下，供试品在对照品色谱保留时间相应处有相同色谱峰，而阴性对照无干扰；样品可得到较好的分离，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算大于3 000。

　　2.4 线性关系考察精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10，20 μl依次进样，按测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，盐酸小檗碱进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=3 682.4X+15.645,r=0.999 8，表明盐酸小檗碱在0.08～0.8 mg范围内线性关系良好。

　　2.5 精密度实验精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液Ⅱ,重复进样5次，50 μl/次，依法测定峰面积值，其RSD=0.15%。结果表明，仪器精密度良好。

　　2.6 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，分别于0，1，3，5，12 h进样5 μl，依法测定峰面积值，其RSD=1.20%。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

　　2.7 重复性实验精密称取同一批(批号040602)样品5 份，按供试品溶液项下制备，每份样品测定2次，计算RSD=1.55%。结果表明，供试品溶液的制备方法重复性良好。

　　2.8  加样回收率实验精密称取已知含量(4.85 mg·g-1)的样品共5份，分别精密加入对照品适量，依法测定，每份测定两次，计算回收率。结果见表1。表1  回收率实验结果（略）

　　表1结果表明，本法平均回收率98.59%，RSD= 2.74%，表明本法准确度较好，方法可行。

　　2.9 提取方法的考察［6,7］

　　2.9.1 方法1取本品适量，研细(过80目筛)，精密称定约1.0 g，置50 ml容量瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)45 ml，60℃水浴中加热15 min，取出后超声30 min，放置过夜，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.9.2 方法2取本品适量，研细(过80目筛)，精密称定约1.0 g，置50 ml容量瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)45 ml，60℃水浴中加热15 min，取出后超声60 min，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.9.3 方法3取本品适量，研细(过80目筛)，精密称定约1.0 g，置50 ml容量瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)45 ml，60℃水浴中加热15 min，取出后超声30 min，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。按上述3种方法提取后测定结果相似，考虑到节省时间等因素选择方法3为提取方法，并列入正文。

　　2.10 样品含量测定结果取10批样品，依法制备供试品溶液，每批2份，精密吸取供试品溶液20 ml，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算5批样品的含量。结果见表2。

　　根据表2中10批样品的含量测定结果，考虑到原材料的质量的差异和工艺过程中复杂因素的影响，暂定本品每克含黄连以盐酸小檗碱计不得少于3 mg。

　　2.11 药材含量测定取黄连药材粉末(过3号筛)0.5 g，精密称定，置50 ml容量瓶中，加盐酸-甲醇(1∶100)45 ml，60℃水浴中加热15 min，取出后超声30 min，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液10 ml及对照药材溶液10 ml，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算3批样品药材中盐酸小檗碱的含量。结果见表3。表2  10批样品中盐酸小檗碱的含量测定结果（略）表3  黄连药材中盐酸小檗碱含量测定结果（略）

　　根据以上结果，暂定黄连药材按干燥品计算，含盐酸小檗碱不得少于4.0%，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部“黄连”项下含量限度要求。

　　3  讨论

　　3.1  测定波长的选择取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每毫升中含0.1 mg的溶液，于紫外可见分光光度计在200～500 nm波长范围内进行扫描，结果在345 nm波长处有最大吸收，故选定检测波长为345 nm。

　　3.2  流动相的选择分别选择水-冰醋酸-三乙胺-乙腈(60∶0.3∶0.8∶40)、乙腈0.05 mol·L-1-磷酸二氢钠溶液(pH=5.0) (28∶72)为流动相，结果乙腈:0.05 mol·L-1磷酸二氢钠溶液(pH=5.0) (28∶72)分离效果较好，故确定为本法的流动相，并列入正文。

　　【参考文献】

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　　［3］曹泰山，王丹.人参皂苷Rg与人参皂苷Re含量测定方法的研究［J］.时珍国医国药，2005，16(8):739.

　　［4］李清，王璐，戴荣华，等.高效液相色谱法测定黄连解毒汤中盐酸小檗碱的含量［J］.西北药学杂志，2004，19(2):51.

　　［5］余少婷，黄红雯. HPLC测定黄连上清片中盐酸小檗碱的含量［J］.中成药，2004，26(8):634.

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　　［7］赵沈娟，黄新兰，刘婷. RP-HPLC法测定荜铃胃痛颗粒中盐酸小檗碱的含量［J］.中国药事，2006，20(11):682.