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【摘要】目的建立测定喘平滴丸中东莨菪碱含量的高效液相色谱法。方法采用ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇－0.001 mol·L-1磷酸（70∶30）（流动相含0.02 mol· L-1十二烷基硫酸钠）为流动相，检测波长：216 nm，流速：1.0 ml·min-1，外标法定量。结果东莨菪碱在0.028 5～0.285 μg范围内呈线性关系，方法回收率为98.86%（n=6），RSD为2.54%。结论此法简便、准确，重复性好，可用于喘平滴丸中东莨菪碱含量测定。
【关键词】 高效液相色谱法 喘平滴丸 东莨菪碱
喘平滴丸由麻黄、洋金花等中药组成的中药复方制剂。其中洋金花的主要化学成分东莨菪碱，有显著的中枢抑制、麻醉作用，一般剂量就能消除情绪激动，使人产生倦意，进入无梦的睡眠状态，产生“健忘”等症，严重者嗜睡、昏迷，最后死于呼吸中枢抑制或麻痹，呼吸和循环衰竭。方中洋金花处方量虽然比例小，为了该复方制剂的用药安全，本课题组对该复方制剂中微量的东莨菪碱进行含量监控，为该药的安全使用提供数据参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent1100高效液相色谱仪系列(G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1314A-VWD检测器)；色谱柱:ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），SN: USCL017850， BP211D电子分析天平(Sartorius)。
1.2 试药
甲醇为色谱纯试剂，水为三蒸水，其它试剂均为分析纯。氢溴酸东莨菪碱对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号：100049-200308)，喘平滴丸3批（本所研制，批号：20070516，20070518，20070520）。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备取氢溴酸东莨菪碱对照品约10 mg，精密称定，置50 ml容量瓶，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀,得对照品贮备液。精密量取对照品贮备液1.0 ml ,置10.0 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。即得（0.021 4 mg·ml-1）。
2.1.2 供试品溶液的制备取本品20丸，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10 ml 0.01％盐酸超声溶解，用浓氨水调pH值至9，转移入梨形分液漏斗中，用氯仿（15，15，10，10 ml）分次萃取，取氯仿层至蒸发皿中，用甲醇溶解转入10 ml量瓶中，滤过（0.22 μm），取续滤液即得。
2.1.3 阴性样品溶液的制备按处方工艺制备缺洋金花的浸膏，依供试品溶液制备方法制备。
2.2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇－0.001 mol·L-1磷酸（流动相含0.02 mol·L-1十二烷基硫酸钠）（70：30），检测波长216 nm，流速1.0 ml·min-1。在上述色谱条件下，分别吸取对照品溶液12 μl，供试品溶液和阴性对照溶液各3 μl，注入液相色谱仪，色谱图见图1～3。
供试品与氢溴酸东莨菪碱对照品相同的保留时间有一对应色谱峰，阴性对照溶液在对应位置无干扰；以氢溴酸东莨菪碱计算，理论塔板数在3 000以上。分离度＞1.5，故此色谱条件满足测定要求。
2.3 线性关系考察精密吸取上述对照品溶液（0.021 4 mg·ml-1）1，2，4，8，12，16，20 μl进样，测定其峰面积积分值，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，氢溴酸东莨菪碱回归方程为：Y＝743.95X+3.478 67，r＝0.999 9。结果表明氢溴酸东莨菪碱在0.028 5～0.285 μg范围内线性关系良好。
2.4 精密度实验精密吸取供试品溶液3 μl，按上述色谱条件重复进样6次，测定其峰面积，RSD=0.71％，表明精密度良好。
2.5 重复性实验对同一批样品（批号20070516）按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试液，每份进样3次，3 μl/次，测得峰面积并计算每丸平均含量，RSD=2.31%，表明本法重复性较好。
2.6 稳定性实验取新制备的供试品溶液（批号20070516），按上述色谱条件于0，1，2，4，8，12 h分别进样3 μl，测定其峰面积，RSD为1.73％，表明本品在12 h内稳定性较好。
2.7 回收率实验精密称取已知含量的同一批样品（20070516，含量为0.084 95%）6份，每份8丸，分别精密加入0.8 ml的东莨菪碱对照品溶液（0.285 mg·ml-1），按供试品溶液制备项下操作，最后定容为10 ml，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。表1 氢溴酸东莨菪碱回收率测定结果（略）
2.8 含量测定及限度取本品3 批, 每批分别取3份样品，按“2.1.2”项下方法制备供试液，每份样品平行进样3次，按拟定的含量测定方法测定。结果见表2。表2 样品含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 供试品纯化方法的筛选本品处方中洋金花比例较低，目标成分东莨菪碱含量低，且复方中相关成分干扰，所以检测东莨菪碱经过了多个实验纯化富集：首先将样品溶解后分别以氨水饱和的醋酸乙酯、氨水饱和的正丁醇、氨水饱和的氯仿作洗脱溶剂洗脱过氧化铝柱，对比发现饱和氯仿洗脱液得到的峰分离度和基线较好，但回收率低。然后又分别以氨水饱和的醋酸乙酯、氨水饱和的正丁醇、氨水饱和的氯仿进行萃取3次（15，15，10 ml），合并萃取液，比较发现饱和氯仿萃取的样品基线平稳，色谱峰分离度最好，且回收率达到检测要求。
3.2 检测波长的选择在选定的色谱条件下，注入东莨菪碱对照品、样品和阴性样品，用DAD检测器检测，读取DAD光谱扫描图，发现东莨菪碱对照品和样品的东莨菪碱洗脱峰在210～220 nm处有较大吸收，而阴性样品在该段吸收弱，所以确定检测波长为216 nm。
3.3 流动相的选择HPLC法测定氢溴酸东莨菪碱,已报道的流动相有0.07 mol·L-1磷酸钠溶液(用磷酸调pH 值至6.0 ,含17.5 mmol·L-1十二烷基硫酸钠) - 乙腈(2∶1)［1，2］，甲醇- 水(53∶47,水中含20 mmol·L-1醋酸钠,0.02 %三乙胺,0.3 %四氢呋喃,pH 为6.86)［3］ ,甲醇- 水(40∶60,水中含0.02 mol·L-1醋酸钠,0.02 %三乙胺,用冰醋酸调pH 至6.0)［4］等。本文曾分别以甲醇- 磷酸盐缓冲液、乙腈－0.03％三乙胺（以不同体积比及不同pH值）、水－乙腈（含0.1％三乙胺）－磷酸（以不同体积比）等为流动相进行测试,均未达到满意的分离效果。后改用反相离子对流动相，经多次筛选发现:甲醇－0.001 mol·L-1磷酸（70∶30）（流动相含0.02 mol·L-1十二烷基硫酸钠）改善了分离效果,使得性质相似的其它干扰成分能在反相系统中相互达到基线分离。
【参考文献】
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