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【摘要】 目的测定附子中乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的含量。方法采用反相高效液相色谱（PR-HPLC）法，使用UltimateTM XB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)；流动相为乙腈-0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值为7.29）；检测波长：230 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温为35℃。结果乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的回归方程分别为：Y=31.258X+5.794，r=0.999 9；Y=17.418X+5.236 9，r=0.999 8；Y=18.989X+6.186 6，r=0.999 7。三者的线性范围分别为：3.3125～106μg/ml；0.735 7～23.541 9μg/ml；1.966 1～62.916 4μg/ml。结论该方法简便、准确、分离效果好、灵敏度高,可用于附子的质量控制。
【关键词】 附子 反相高效液相色谱 乌头碱 新乌头碱 次乌头碱
Abstract：ObjectiveTo develop a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of three principal alkaloids in aconite root. Methods（4.6mm×250mm, 5μm）column by isocratic elution using Acetonitrile -0.2%Glacial acetic acid（adjusted to pH 7.29 with concentrated ammonia）.ResultsThe average recovery of the three alkaloids were analyzed simultaneously with UltimateTM XB-C18 rates obtained were in the range of 98.93-100.5% for RSD below 2.0%.The linear ranges of aconitine; hypaconitine; mesaconitine were respectively 3.312 5～106 μg/ml, 0.7357～23.5419 μg/ml,1.9661～62.9164μg/ml (r=0.999 9, r=0.999 8, r=0.999 7).ConclusionThe contents of alkaloids in aconite root varied significantly from species; hence quality control of aconite root is very necessary.
Key words：Aconite root; RP-HPLC; Aconitine; Hypaconitine; Mesaconitine
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根加工品［1］。附子性大热，味辛、甘，有毒，具回阳救逆，补火助阳，散寒止痛等功效，具有强心、降压、抗炎和镇痛等作用。附子中生物碱主要有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱为剧毒化合物，附子经过炮制后，其生物碱的含量下降，为控制药物的毒性，检测附子中双酯型生物碱的含量是非常必要的。
附子生品有大毒，其中所含的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯类生物碱既是有效成分，又是毒性成分，且治疗量与中毒量接近，经加工炮制后此类成分可转化为单酯型生物碱，从而减小毒性 。附子的毒性与炮制方法有关，炮制不及，则可中毒；炮制太过，则不能保证药效［2］。目前并没有能够同时控制毒性和保证疗效的炮制工艺规范，也不能够表明附子安全性和有效性的科学、量化的质量标准，造成各地附子炮制品的质量相差很大。为此本研究建立了灵敏准确的检测方法，对附子炮制品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱进行了定量分析，为有效地评价和控制附子炮制品质量，规范炮制工艺提供科学依据。
1 仪器与试剂
1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪，G1314B VWD检测器，Agilent chmstation工作站；Sartorius分析天平，KQ-250VDB型双频数控超声清洗器。
1.2 试剂 乌头碱(110720-200410)、新乌头碱(110799-200404)、次乌头碱(110798-200404)对照品购自中国药品生物制品检定所，水为双蒸水(实验室自制)，乙腈(HPLC级，Tedia，美国)，甲醇(HPLC级，Tedia，美国)，附子药材为四川布拖GAP种植基地购买（由江西中医学院生药组褚小兰老师鉴定），其他试剂为分析纯。
2 方法
2.1 混合对照品溶液的配制分别精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱对照品1.59，1.13，1.51 mg，置于10 ml容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度线，摇匀，即得对照品储备液。
2.2 供试品溶液的配制取不同产地的黑附片适量，粉碎，过筛。分别取黑附片粉末5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加10%氨水5 ml，湿润0.5 h，再加入乙醚50 ml，超声提取10 min，密塞，放置过夜，过滤，再以5 ml乙醚分3次洗涤药渣，过滤，合并滤液，室温挥干，乙腈溶解残渣，用0.45 μm微孔滤膜过滤，定容至2 ml，摇匀，作为样品溶液。
2.3 色谱条件 UltimateTM XB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.2%冰醋酸（氨水调pH为7.29），过0.45 μm滤膜；检测波长：230 nm；流速：1.0ml·min-1；柱温35℃。
2.4 测定方法 在选定的色谱条件下，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，按外标法计算各生物碱的含量。
3 结果
3.1 方法的专属性精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液10μl，在选定的色谱条件下进样分析，乌头碱、次乌头碱、新乌头碱峰形良好，基线平稳。本方法能准确测定乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的浓度，灵敏度较高，见图1。
图1 高效液相色谱图（略）
3.2 HPLC方法学评价
3.2.1 线性关系考察 分别精密称取“2.1”项下混合对照品储备液10，20，100，200，400，1 000 μl置1ml容量瓶中，加乙腈定容至刻度线，摇匀，分别进样10 μl，按上述色谱条件进行HPLC分析，以峰面积Y对样品浓度(μg/ml)进行回归处理，得到乌头碱、新乌头碱、次乌头碱的回归方程分别为：Y=31.258X+5.794，r=0.999 9；Y=17.418X+5.236 9，r=0.999 8；Y=18.989X+6.186 6，r=0.999 7。
三者的线性范围分别为：3.312 5～106 μg/ml；0.735 7～23.541 9 μg/ml；1.966 1～62.916 4 μg/ml。
3.2.2 精密度实验取“2.1”项下混合对照品液，按上述色谱条件进行HPLC分析，连续进样6次，每次进样10 μl，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为1.01%，1.22%，1.07%。
3.2.3 稳定性实验精密称取四川布拖黑附片5g，按“2.2”项下方法制备样品溶液，放置0，3，6，9，12，24h后，按上述色谱条件进行HPLC分析，每次进样10 μl，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为1.01%，0.54%，1.27%，表明三种生物碱在乙腈溶液中24 h内稳定。
3.2.4 重复性实验精密称取四川布拖黑附片5g 6份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件分别进样10μl，结果样品中的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱含量的RSD分别为1.42%，1.11%，0.99%，说明该方法的重复性良好。
3.2.5 加样回收率实验精密称取四川布拖黑附片2.5g 6份，分别加入对照品溶液1ml，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件分别进样10μl，结果样品中的乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的平均加样回收率分别为99.47% (RSD=1.11%)，100.5% ( RSD=1.19%)，98.93% ( RSD=1.53%)。
3.3 样品含量测定 分别取“2.2”项下样品溶液及混合对照品溶液进样10μl测定（见表1）。由表1可知，所产附子炮制品所含3种双酯型生物碱的含量差异很大。
表1 不同产地黑附片的测定结果（略）
“-”未检测
4 讨论
本实验对甲醇-0.1%三乙胺、乙腈-0.1%三乙胺、乙腈-40mmol的醋酸铵（浓氨水调节pH值）、乙腈-0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值）等系统作为流动相进行色谱分析，结果表明乙腈-0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值）可使附子中3种双酯型生物碱达到完全分离，且基线平稳，所以选择乙腈-0.2%冰醋酸（浓氨水调节pH值为7.29）为流动相。
本实验中，我们考察了乙醇、乙腈、甲醇对样品分析的影响，发现乙腈对样品的干扰较小，且溶解效果也比较好，因此选择乙腈作为定容溶剂。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005：575.
［2］ 王兆基,关锡耀,徐树棋.毒性中药生川乌质量标准研究［J］.中成药,2005,28(5):651.