高效液相色谱法测定紫花高乌头中乌头碱的含量

　　【摘要】 目的测定紫花高乌头中乌头碱的含量，为蒙药紫花高乌头中乌头碱的含量提供检测方法，制定质控标准。方法采用高效液相色谱法，Kromasil (250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，甲醇水三乙胺 （71∶29∶0.1）为流动相，流速为1.0 ml/min；检测波长235 nm。结果乌头碱浓度在29.85～149.25 μg/ml范围之间与峰面积线性关系良好，r=0.999 7。乌头碱平均回收率为96.52%，RSD=1.19%。结论采用高效液相色谱法测定紫花高乌头中乌头碱的含量，具有分离效果好、简便、结果准确等优点。

　　【关键词】  紫花高乌头 乌头碱 高效液相色谱法

　　紫花高乌头为毛茛科植物紫花高乌头Aconitum excelsum Rrichb.的全草，蒙药名为宝日-泵嘎,收载于《中华医学百科全书》（蒙医分卷）《认药白晶鉴》《无误蒙药鉴》中，具有止咳、清肺之功效,主治流感、肺感、肺热、瘟疫等作用［1］，其中乌头碱既是其有效成分,也是其毒性成分。《中国药典》［2］采用比色法检查乌头碱的含量,而本研究建立了以高效液相色谱测定紫花高乌头中乌头碱含量的方法，以控制蒙药材紫花高乌头的质量。

　　1  器材

　　1.1  仪器依利特UV-230+高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司): UV-230+紫外-可见检测器、P230/P230p高压恒流泵、EC2000色谱工作站。

　　1.2  材料紫花高乌头采自内蒙古赤峰市克什克腾旗大局子林场、赤峰市克什克腾旗红山子乡、赤峰市宁城县，经内蒙古医学院药学院生药学教研室庞秀生教授鉴定为毛茛科植物紫花高乌头Aconitum excelsum  Rrichb.的全草。方法学考察中均采用赤峰市克什克腾旗大局子林场所采集到的样品。乌头碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110720-200308）；甲醇为色谱纯，磷酸、盐酸等试剂均为分析纯，水为双蒸水。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为Kromasil (250 mm×4.6 mm，5 μm),流动相为甲醇水三乙胺 （71∶29∶0.1）；流速为1.0 ml/min；检测波长235 nm；进样量20 μl。以此条件，乌头碱能与其它成分达到较好分离效果。结果见图1～2。

　　2.2  对照品溶液的配制取乌头碱对照品5.9 mg，精密称定，置10 ml容量瓶中，然后加甲醇至刻度，摇匀，即得（每毫升中含乌头碱0.597 mg）。

　　2.3  供试品溶液的制备取本品10 g，过60目筛，精密称定，加氨试液4 ml，苯50 ml，超声30 min，用酸水（2%盐酸）萃取两次，20 ml/次，酸水调pH值为9，用氯仿萃取2次，20 ml/次，合并氯仿液，低温减压挥干，残渣用甲醇溶解，定容至10 ml容量瓶中，摇匀，即得。

　　2.4  标准曲线的制备精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml对照品溶液分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别吸取20 μl注入高效液相色谱仪,记录峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标,对照品峰面积为纵坐标,进行线性回归,标准线性回归方程为Y=18.269X-25.583，r=0.999 7。实验表明，乌头碱浓度在29.85～149.25 μg/ml范围内呈良好的线性关系。

　　2.5  精密度实验取供试品溶液，重复进样5次，记录峰面积并计算，结果乌头碱的平均含量为0.069 5 mg/g，RSD为0.86%。

　　图1  乌头碱对照品HPLC图谱（略）

　　图2  紫花高乌头HPLC图谱（略）

　　2.6  稳定性实验取紫花高乌头供试品溶液在0，1，2，3，4，5，6，9 h分别进样20 μl，记录峰面积，结果RSD为1.43%，表明乌头碱在9 h内保持稳定。

　　2.7  重复性实验取赤峰市克什克腾旗大局子林场供试品5份，各约1 g,精密称定，分别按样品提取方法提取、测定，结果乌头碱品均含量为0.067 1 mg/g，RSD为1.78%。

　　2.8  加样回收率实验取赤峰市克什克腾旗大局子林场供试品5份，各约5 g,精密称定，分别加入乌头碱标准品溶液（0.351 mg/ml）1 ml，按供试品溶液的方法处理并测定含量，计算加样回收率。结果见表1。乌头碱平均回收率为96.52%，RSD为1.19%。结果表明本方法准确可靠。

　　表1  样品中乌头碱含量加样回收实验结果（略）

　　2.9  样品含量测定取3个批次的样品各两份，每份约10 g,精密称定，按“2.3”项下操作，取20 μl注入高效色谱仪，以色谱条件测定，计算乌头碱的含量。结果见表2。

　　表2  样品含量测定结果（略）

　　3  讨论

　　中药成分的提取多采用冷浸渗流法、煎煮法、有机溶剂加热回流提取法，但提取的效果不尽相同。曾采用苯加氨试液浸泡，放置过夜的方法，对紫花高乌头进行提取，但效果不甚理想。本实验采用在碱性条件下用苯超声提取，提取液滤过后低温减压挥干。残渣加甲醇溶解后进行色谱分析的方法，本法与上述其它方法比较提取较完全，而且操作简便。同时，采用超声提取即防止成分遇热易分解，又大大提高了提取效率。有作者曾对紫花高乌头根中的二萜生物碱进行了提取与鉴定［3,4］，而采用高效液相色谱法对紫花高乌头中的乌头碱进行测定，尚未见报道。本研究同时建立了蒙药材紫花高乌头的质量控制标准。实验结果显示，采用高效液相色谱法测定乌头碱的含量，结果准确，重复性好，为蒙医药的临床应用提供了更为有效的检测方法。

　　【参考文献】

　　［1］ 王 晋,乔俊缠,任常胜，等.蒙药紫花高乌头微量元素的含量测定［J］.中国民族医药杂志,2001,7(3):34.

　　［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社, 2005:189.

　　［3］ 张树祥,贾世山.蒙药紫花高乌头根中二萜生物碱的分离与鉴定［J］.中草药,1999,30(9):641.

　　［4］ 张树祥,贾世山. 蒙药紫花高乌头根中新二萜生物碱的分离和鉴定［J］.药学学报,1999,34(10):762.