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【摘要】目的建立同时测定杜仲叶中芦丁、槲皮素、山萘酚的高效液相色谱法。方法采用Spherisorb BDS C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（甲醇：0 min，30%；10 min，30%；30 min，50%；40 min，60%；50 min，30%），流速1 ml·min-1，检测波长350 nm。结果样品中芦丁、槲皮素、山萘酚的加样回收率分别为96%～98%，93% ～97%，96% ～101%；芦丁、槲皮素、山萘酚的线性范围分别为0.579～5.79 μg，r=0.999 9；0.12～1.20 μg，r=0.999 8；0.109～1.09 μg，r=0.999 9。 结论贵州不同产地杜仲叶药材中芦丁、槲皮素、山萘酚的含量差异很大。
【关键词】 高效液相色谱法 杜仲叶 芦丁 槲皮素 山萘酚
杜仲Eucommia ulmoides Oliv属国家二级保护植物，是杜仲科杜仲属的落叶乔木，中国特有植物种，系地质史上第四纪冰川运动残留下来的占生孑遗树种［1，2］。具补肝肾、强筋骨、安胎之功效, 主要用于治疗肾虚腰痛, 筋骨无力, 妊娠漏血, 胎动不安, 高血压病［3］，其皮是我国特有的名贵滋补药材,近代研究发现杜仲叶与皮含有相同的化学成分，具有相同的药理作用，杜仲叶也是各种名贵保健品的重要原料。黄酮类化合物是杜仲药材的主要有效成分之一, 具有多种生物活性，杜仲中黄酮类化合物含量的高低, 也是判断杜仲药材及其相关产品的重要指标［4，5］。近年来，对杜仲黄酮类含量的测定多采用比色法和高效液相色谱法［6，7］，测定多为单一指标芦丁的定性定量分析，对于同时测定黄酮类物质（芦丁、槲皮素、山萘酚）3种有效成分还未见报道。为了充分合理的开发利用贵州省的杜仲资源，本文采用高效液相色谱法同时对杜仲叶中的黄酮类3种有效成分进行了定性定量分析。
1 仪器与试药
Waters 515 泵, 2996光电二极管检测器(PAD) ,7725i手动进样器, Spherisorb BDS C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱, Empower 色谱工作站。
芦丁对照品（批号086-9303），槲皮素对照品（批号 081-9003），山萘酚对照品（批号 0861-9901）均购于中国药品生物制品检定所；杜仲叶均采自贵州各杜仲产地（经贵阳中医学院刘克汉老师鉴定）；甲醇色谱纯、磷酸为分析纯；水为二次重蒸水。
2 方法与结果
2 .1 溶液的制备
2.1.1 对照品储备液 分别精密称取对照品适量，用60%乙醇溶解后置于25 ml的容量品，并稀释至刻度，配置成含芦丁2.795 mg·ml-1、槲皮素0.600 mg·ml-1、山萘酚0.545 mg·ml-1的对照品储备溶液。
2.1.2 对照品溶液 分别精密吸取对照品储备溶液1 ml，置于10 ml的容量品中，用60%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，配置成含芦丁0.279 5 mg·ml-1、槲皮素0.060 0 mg·ml-1，山萘酚0.054 5mg·ml-1的对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液 精密称取杜仲叶粉末（过60目筛）2 g，于100 ml锥形品中，加入60 ml 60%乙醇溶液，称定重量，冷浸8 h、超声提取3 h，冷却后用相应的醇浓度补足重量。经0.45 μm的滤膜滤过，续滤液供HPLC分析。
2.2 色谱条件色谱柱为Spherisorb BDS C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（甲醇：0 min，30%；10 min，30%；30 min，50%；40 min，60%；50 min，30%），流速：1 ml·min-1，柱温35℃检，检测波长350 nm。在该色谱条件下，芦丁、槲皮素、山萘酚分离良好，且不受药材中杂质的干扰。理论塔板数不小于4 000。见图1。
图1 芦丁、槲皮素、山萘酚对照品色谱图 （略）
图2 杜仲叶样品色谱图（略）
2.3 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液依次进样2，5，8，11，14，17，20 μl。按“2.2”色谱条件分析，以Y（AV.S）为峰面积，X（μg）为进样量，芦丁、槲皮素、山萘酚方程分别为：Y芦丁=1 14 28X+6 91.404，r=0.999 9、Y槲皮素=2 022 916X-5 760.250，r=0.999 8、Y山萘酚=2 177 870X-6 649.655，r=0.999 9。结果表明，芦丁、槲皮素、山萘酚分别在0.579～5.79，0.12～1.20，0.109～1.09 μg间呈良好的线性关系。
2.4 精密度实验对同一份杜仲叶样品平行测定5次， 芦丁、槲皮素、山萘酚的RSD分别为：0.23%，1.5%，0.53% （n=5）。
2.5 重复性实验精密称同一份杜仲叶样品5份，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下分别测定，芦丁、槲皮素、山萘酚的RSD分别为：0.76%，0.69%，0.60%（n=5）。
2.6 回收率实验精密称取已测含量的杜仲药材粉末9份，每份2 g，按样品含芦丁、槲皮素、山萘酚的80%，100%，120%精密加入芦丁、槲皮素、山萘酚对照品储备溶液，按“2.1.3”的方法制备供试溶液，进样量10 μl。结果芦丁、槲皮素、山萘酚的回收率分别为96%～98%，93% ～97%，96% ～101%；精密度（RSD）分别为1.7%～2.0%，1.5%～2.7%，0.9%～2.5%(n=3)结果见表1。
2.7 供试品溶液稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12h测定，芦丁、槲皮素、山萘酚含量的RSD分别为1.7%，2.2%，1.9%(n=7)，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.8 样品的测定分别取贵州不同产地的杜仲叶药材按“2.1.3”方法制备供试品溶液、按“2.2”的色谱条件进行含量测定。结果见表2。实验结果表明，贵州不同产地的杜仲叶中的芦丁、槲皮素、山萘酚的含量差异很大，其含量关系为，威宁＞清镇＞熄峰＞遵义＞大方＞罗甸；由于对树龄的估计没有准确性，实验中以杜仲树胸径进行比较，关系为：清镇＞遵义＞熄峰＞大方＞威宁＞罗甸，由结果可知杜仲叶黄酮类成分的积累和杜仲树胸径的大小没有直接联系。
表1 回收率实验结果（略）
表2 杜仲叶药材含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 提取溶剂的选择 芦丁、槲皮素、山萘酚属于黄酮类化合物，易溶于水及强极的溶剂中，本文选择甲醇、乙醇和水3种溶剂作为提取溶剂，结果表明，以60%的乙醇溶液作为提取溶剂时，芦丁、槲皮素、山萘酚提取较完全。
3.2 提取方法的选择本文考虑了超声、回流、索氏提取3种提取方法，发现超声提取效率明显高于其他两种提取方法，这和文献报道的黄酮类提取方法结果一致［6］；实验中通过比较了冷浸时间、料液比、提取时间对提取率的影响。结果表明，以冷浸8 h、料液比1∶30、超声提取3 h，提取效果最佳。
3.3 检测波长的选择芦丁、槲皮素、山萘酚的对照品溶液进行PDA全波长紫外分析，并比较各组分的紫外吸收强度，对各波长进行比较，发现在350 nm处3组分都具有较好的灵敏度，应此，选择350 nm为检测波长。
3.4 色谱柱的选择在实验过程中比较了不同品牌的C18色谱柱对检测结果的影响，发现Diamonsil C18柱分离样品时间较长，芦丁脱尾严重，分离度差；waterC18柱不能将芦丁和杂质峰完全分离；Spherisorb BDS C18可使3组分与杂质很好的分离，且峰形较好，灵敏度高，适合黄酮类物质的分离。
3.5 流动相的选择实验中比较了乙腈与磷酸水溶液，甲醇与磷酸水溶液对样品分离的影响，发现用乙腈作为流动相时峰形较好，但杂质出峰较快，不能与有效成分完全分离；使用甲醇作为流动相时效果较明显，经过梯度洗脱可将杂质完全分离，并调整磷酸的比例，以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱效果最佳。
3.6 pH值对提取率的影响实验中比较了盐酸加入量水解黄酮苷对提取率的影响，发现随着pH的增加芦丁、槲皮素、山萘酚的含量变化不大，故实验中采用直接加入60%乙醇溶液进行处理。
3.7 产地对黄酮类含量的影响含量测定结果表明，贵州不同产地杜仲叶药材黄酮类成分含量差异很大，其中以威宁县平均海拔两千多米的杜仲叶总黄酮含量最高，以罗甸平均海拔五百多米的最低。可知海拔高度对黄酮类成分的积累具有一定的影响，对于影响黄酮类成分积累的主要环境因子还有待进一步研究。
本实验方法简便，快速准确，可用于杜仲药材及其相关产品的质量控制和评价。
【参考文献】
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［5］ 张德权，台建详，付 勤. 生物类黄酮的研究及应用概况［J］. 食品与发酵工业，1999，25 (6)： 52.
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