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【摘要】目的建立了枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁、槲皮素含量的测定方法，同时测定了枳实提取物的抗氧化作用。方法采用HPLC法，色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温37℃，流动相为乙腈-磷酸溶液，检测波长280，365 nm，流速1.0 ml/min 。采用DPPH·测定枳实提取物的自由基清除能力。结果进样量范围：柚皮苷为1.143～5.717 μg，橙皮苷为0.092～0.459 μg，新橙皮苷为1.179～5.895 μg，芦丁为0.024～0.118 μg，槲皮素为0.079～0.395 μg。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分别为99.604%，100.150%，100.249%。RSD分别为0.515%，4.390%，0.774%。枳实提取物对DPPH·清除作用是柚皮苷的17.6倍。结论HPLC测定法简便、准确，可用于测定枳实类黄酮含量，同时枳实提取物具有较强的自由基清除作用。
【关键词】 枳实； 类黄酮； 高效液相色谱法； 抗氧化作用
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of naringin, hesperidin, neohesperidin, rutin and quercetin in Citrus aurantium L., and to study antioxidant activity .MethodsThe samples were extracted with ethanol. The chromatographic conditions were as follows: Phenomenex Gemini C18 column (150 mm×4.6 mm,5μm), column temperature at 37℃, mobile phase of acetonitrile-phosphate solution, detection wavelength at 280nm or 365nm, flow rate 1.0ml/min. In addition, DPPH radical-scavenging was employed to measure antioxidant activities. ResultsThe calibration curves were linear in the range of 1.143～5.717μg for naringin, 0.092～0.459μg for hesperidin, 1.179～5.895μg for neohesperidin, 0.024～0.118μg for rutin and 0.079～0.395μg for quercetin. The average recoveries of naringin, hesperidin, neohesperidin were 99.604%, 100.150% and 100.249% respectively. RSD were 0.515%, 4.390% and 0.774% respectively. The DPPH radical scavenging activity of C. aurantium L. flavoniods was 17.6 times of naringin. ConclusionThe method is simple, accurate for detecting flavoniods in C. aurantium L., and the C.aurantium L .extract has antioxidant activities.
Key words：Citrus aurantium L. ； Flavoniods ; High performance liquid chromatography; Antioxidant activity
枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，具有破气除痞、化痰消积的功效，是中医临床常用药物［1］。
关于测定枳实类黄酮的HPLC法大部分报道是测定柚皮苷、橙皮苷［2，3］，而对于新橙皮苷、芦丁、槲皮素的测定，少有报道，同时对于枳实类黄酮的抗氧化作用未见报道。本研究采用HPLC测定枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁、槲皮素的含量，同时测定了枳实类黄酮对DPPH自由基的清除作用，为枳实药用的深入研究提供基础。
1 材料、试剂与仪器
枳实购买自成都荷花池中药材市场（经鉴定为酸橙幼果Citrus aurantium L）；芦丁(生物制品检定所，批号100080-200306) 、柚皮苷、新橙皮苷( sigma）；槲皮素、橙皮苷（Fluka ）；2,2-二苯代苦味酰基（2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（sigma）。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。Waters HPLC(waters 515 pump，water 2487 UV)，752PC型紫外可见分光光度计。
2 方法
2.1 枳实提取方法枳实提取物（C.aurantium L. ethanol extract, CEE）：枳实粉碎，以70%乙醇，料液比1∶30，温度80℃，回流提取3次，2 h/次，合并滤液，60℃真空浓缩，冷冻干燥，得浅棕色粉末。
2.2 枳实内黄酮的测定（HPLC法，芦丁、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、槲皮素为对照）色谱条件： Phenomenex Gemini C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温37℃，流动相A：100%乙腈，B: 0.075%磷酸溶液，梯度洗脱：0%～15 min，A（15%～20%）；15～20 min, A(20%～80%); 20～23 min, A(80%～100%); 23～24 min, A(100%～15%); 24～30 min, A(15%)。流速1.0 ml/min，检测波长分别是280，365 nm，进样量10μl。
2.3 DPPH·的清除作用［4］准确称取2,2-二苯代苦味酰基标准品20 mg，无水乙醇溶解定容至500 ml，得浓度为0.04 mg/ml溶液。取此溶液3 ml，加入不同浓度的试样溶液1 ml，室温，30 min，测定吸光度值A515nm，空白组以1 ml无水乙醇代替试样，并按下式计算清除率：
DPPH·清除率（%）=（1-A试样/A空白）×100%
3 结果
3.1 线性关系的确定分别精密称取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、芦丁及槲皮素对照品142.920，147.375，11.466，2.962，9.880 mg以甲醇∶二甲亚砜（1∶1）溶解并定容至50 ml，得对照品储备液。并将溶液稀释5倍后，分别以5，7.5，10 μl进样；将溶液稀释12.5倍后，分别以5，7.5，10 μl进样，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷在280 nm，芦丁及槲皮素在365 nm处测定。记录色谱图，见图1～2。以峰面积为纵坐标(Y)，绝对进样量(μg/ml)为横坐标(X)作图，见图3，结果见表1。
表1 5种对照品的标准曲线（略）
图1 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照色谱图（略）
图2 芦丁、槲皮素对照色谱图（略）
图3 柚皮苷标准曲线（略）
3.2 回收率实验精密称取153.75 mg的枳实提取物，以甲醇∶二甲亚砜（1∶1）溶解并定容至25 ml，得样品储备液。将3份1 ml的样品储备液分别与1，0.9，0.8 ml对照品储备液混合并定容至10 ml，计算柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷回收率。结果见表2。
表2 回收率结果（略）
3.3 重复性实验精密称取6份枳实提取物，样品以甲醇：二甲亚砜（1∶1）溶解并定容至50 ml，得样品储备液。测得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量为20.940%，1.126%，18.936%。RSD分别为0.515%，4.390%，0.774%。
3.4 样品测定精密称取6份枳实提取物，样品以甲醇∶二甲亚砜（1∶1）溶解并定容至50 ml，得样品储备液。测得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁和槲皮素的平均含量分别为（20.940±0.108）%，（1.126±0.049）%，（18.936±0.147）%，（0.024±0.005）%，（0.048±0.018）%。见图3～4。
图4 枳实提取物色谱图(280 nm)（略）
图5 枳实提取物色谱图(365 nm)（略）
3.5 枳实提取物对DPPH·清除作用结果见表3。从表3可见，芦丁、槲皮素、柚皮苷、枳实提取物具有DPPH·清除作用，并呈线性关系。他们的线性关系分别为：Y=-0.026 4X2+3.083 1X-1.068 8，R2=0.994 9；Y=5.453 3X+5.965 3，R2=0.979 7；Y=0.004 9X+3.311 4，R2=0.999 5；Y=0.075 2X+9.389 9，R2=0.989 7。
半抑制浓度DC50分别为19.984，8.075，9528.286，540.028 μg/ml。枳实提取物对DPPH·的清除作用低于芦丁和槲皮素，但高于柚皮苷，是柚皮苷清除作用的17.6倍，具有较强的抗氧化作用。
表3 枳实提取物与对照品对DPPH·清除作用（略）
4 讨论
柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷是枳实中主要黄酮苷类化合物，具有相同的共轭体系，紫外扫描在280 nm处有最大吸收峰。芦丁、槲皮素具有相同的共轭体系，检测波长在365 nm。通过HPLC测定，枳实提取物中含有较高的柚皮苷、新橙皮苷，同时也含有橙皮苷、少量芦丁和槲皮素。
关于类黄酮的抗氧化活性，取决于类黄酮的化学结构，B环上有邻二羟基及C环上具有Δ2-3双键，其抗氧化活性高［5，6］，芦丁与槲皮素具有以上结构，而柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷没有以上结构，因此芦丁与槲皮素的抗氧化活性高于柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷。同时槲皮素C 环上具有3-OH ,而芦丁的3-OH被糖苷取代，因此槲皮素的抗氧化性强于芦丁。通过对DPPH·清除作用也证实了抗氧化性的顺序为槲皮素＞芦丁＞柚皮苷，本研究表明枳实提取物中是多种类黄酮混合物，而多种类黄酮的混合具有相当强的协同效应，这可能是其抗氧化活性高于柚皮苷的原因。
【参考文献】
［1］ 彭国平，牛贺明，徐丽华. 枳实活性成分的研究［J］.南京中医药大学学报(自然科学版)，2001，17（2）：91.
［2］ 梁远园，冯 彪，祝晨蔯.HPLC法测定枳实药材中橙皮苷与柚皮苷的含量［J］.中药新药与临床药理，2006 ,17(5)：359.
［3］ 李秀玲，李 龙，肖红斌. 反相高效液相色谱法测定枳实、枳壳中橙皮甙和柚皮甙含量［J］.色谱，2002, 20(6)：585.
［4］ F. Sharififar , M.H. Moshafi, S.H. Mansouri,et al. In vitro valuation of antibacterial and antioxidant activities of the essential oil and ethanol extract of endemic Zataria multiflora Boiss［J］. Food Control ,2007,18：800.
［5］ Elisa T, Maurizio LG, Santo G. Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties: A review［J］.Food Chemistry, 2007, 104( 2)：466.
［6］ Danila DM, Marco G, Maurizio LG, et al. Flavanones in Citrus fruit: Structure-antioxidant activity relationships［J］.. Food Research International, 2005, 38(10)：1161.