高效液相色谱法测定旱莲草中木犀草素和芹菜素的含量

　　【摘要】  目的建立了同时测定旱莲草中木犀草素和芹菜素含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法采用Shim-pack CLC-ODS色谱柱（150 mm×6 mm，5 μm），流动相为乙腈-2%的醋酸水溶液 (体积比为30∶70),流速1.0 ml·min-1,检测波长340 nm,柱温为40℃。结果在上述条件下，木犀草素和芹菜素的质量浓度分别在0.003～0.24 mg·ml-1和0.002 5～0.20 mg·ml-1时与色谱峰面积之间的线性关系良好，两者的平均加标回收率分别为100.6%和102.5%。结论该方法快速、简便、准确，可用于旱莲草中木犀草素和芹菜素的HPLC测定。

　　【关键词】  旱莲草; 木犀草素; 芹菜素; 高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for content determination of luteolin and apigenin in Herba Ecliptae. MethodsHPLC separation was carried out in a Shim-pack CLC-ODS columm (150 mm×6 mm，5μm) with acetonitrile -2% acetic acid (30∶70, v/v) as mobile phase at a flow rate of 1.0 ml·min-1. The detection wavelength was 340 nm and the column temperature was maintained at 40℃. ResultsThere were good linear relationships between the mass concentrations and the peak areas of luteolin and apigenin in the ranges of 0.003～0.24 mg·ml－1 and 0.0025～0.20 mg·ml－1, respectively. The recovery rates were 100.6% and 102.5%, respectively.  ConclusionThis method is rapid, accurate and reproducible for determination of luteolin and apigenin in Herba Ecliptae.

　　Key words：Herba Ecliptae;  Luteolin;  Apigenin;  HPLC

　　旱莲草 (Herba Ecliptae)别名墨旱莲、金陵草、莲子草、旱莲子，为菊科鳢肠属植物的全草, 主产于江苏、浙江、江西、湖北等地，资源丰富。中医用其滋补肝肾,凉血止血,乌须发等［1］。旱莲草的化学成分主要有三萜皂苷、噻吩类、香豆草醚类、黄酮类化合物等［2］。报道研究表明旱莲草中的黄酮类成分具有免疫调节作用和明显的抗自由基及体内抗氧化功能［3，4］，近年来以木犀草素和芹菜素为代表的天然黄酮的药理药效作用也受到日益广泛的关注［5，6］。王自军等［7］用紫外-可见分光光度法测定旱莲草中总黄酮含量, 刘翔等［8］报道用HPLC法检测旱莲草中的木犀草素含量。为了更准确地反映旱莲草药材中黄酮苷元的含量，本实验建立了HPLC法同时检测旱莲草药材中的木犀草素和芹菜素含量。结果表明，该方法简便、准确可靠，为更好地开发利用旱莲草药材资源提供了理论依据。

　　1  仪器与试剂

　　日本岛津SPD-10AT高效液相色谱仪 (LC-10ATvp泵，SPD-10Avp检测器，SIL-10AP自动进样器，CTO-10ASVP柱温箱，CBM-20A控制器)；超纯水器(arium 611UF,Sartorius)；超声波清洗器(AS3120A，天津瑞森特)；电子天平(AdventurerTM，  AR2140，上海奥豪斯公司)； 旋转蒸发仪(R-200,瑞士Buchi)。

　　乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水，蒸馏水自制，其它试剂均为国产分析纯试剂。木犀草素和芹菜素对照品购自成都欧康植化科技有限公司（纯度≥98%）。旱莲草药材购自云南省西双版纳药材公司 (经云南中医学院杨礼攀副教授鉴定为正品)。

　　2  方法和结果

　　2.1  色谱条件色谱柱：Shim-pack CLC-ODS柱（150 mm×6 mm，5μm），流动相：乙腈-2%的醋酸水溶液（30∶70），流速：1 ml·min-1，检测波长：340 nm，柱温：40℃，进样量：20 μl。

　　2.2  对照品溶液的制备分别称取经40℃减压干燥至恒重的木犀草素和芹菜素对照品适量，精密称定，甲醇溶解，制成每毫升含木犀草素0.48 mg，芹菜素0.40 mg的对照品混合溶液，置于4℃的冰箱中保存。 取对照品混合溶液适量，加甲醇制成含木犀草素0.003，0.006，0.030，0.12，0.24 mg· ml-1 ，芹菜素0.0025，0.005，0.025，0.10，0.20 mg· ml-1的系列对照品混合溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备取干燥旱莲草药材粉末(过80目筛)约2.0 g, 精密称定，置于圆底烧瓶中,加入25 ml石油醚加热回流浸提1 h,过滤后药渣用40 ml 85%的乙醇提取两次，每次加热回流提取2 h，过滤，合并提取液，向提取液中加入0.6 ml浓盐酸，在水浴80℃下水解1 h。冷却，用5.0 mol·L-1的氢氧化钠溶液调至pH约中性。用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至10 ml容量瓶中, 用甲醇定容，摇匀，经0.45 μm滤膜过滤，即得。色谱图见图1。

　　2.4  线性关系分别精密吸取 “2.2”项中系列对照品混合溶液20 μl，按照上述色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线回归方程。木犀草素：Y=1E+07X-4 411.8 ， r=0.999 7，线性范围：0.003～0.24 mg·ml－1；芹菜素：Y=2E+07X–24 144， r= 0.999 5，线性范围：0.002 5～0.20 mg·ml－1。

　　2.5  精密度实验取含木犀草素0.12 mg·ml－1，芹菜素0.10 mg·ml-1的对照品混合溶液（“2.2”项下制备），连续进样5次，木犀草素RSD=1.92%,芹菜素RSD=2.16%，表明仪器的精密度良好。

　　图1  HPLC图（略）

　　2.6  稳定性实验样品试液（“2.3”项方法配制）放置0，2，4，18，24 h，分别按“2.1”项色谱条件测定，测得木犀草素的峰面积RSD为1.80%，芹菜素的峰面积RSD为0.92%，表明样品放置24 h稳定。

　　2.7  回收率实验称取已知含量的旱莲草药材粉末5份，每份1.0 g, 精密称定，精密加入每毫升含木犀草素1 mg,芹菜素0.1 mg的混合对照品溶液1 ml，按“2.3”项方法进行样品处理，在上述色谱条件下进行分析测定，计算木犀草素和芹菜素的回收率，结果分别为100.6%，102.5%，RSD分别为2.01%，3.10% （n=5）。

　　2.8  样品的测定按 “2.3”项方法制备的样品溶液，采用上述色谱条件进行分离，经测定，旱莲草药材样品中木犀草素的含量为0.791 mg·g-1，芹菜素的含量为0.064 1 mg·g-1（n=3）。（mg·g-1即1 mg黄酮苷元相当于1 g药材）。

　　3  讨论

　　3.1  检测波长的选择据文献报道［9］ 木犀草素和芹菜素在340～360 nm之间有较大吸收峰, 木犀草素的最大吸收波长为350 nm，芹菜素在340 nm处吸收峰达最大, 考虑到样品中芹菜素含量很低,最后选定340 nm作为检测波长。

　　3.2  提取溶剂的选择本文分别考察了水、乙醇-水（85∶15）混合溶剂作为提取溶剂对提取效果的影响。结果显示采用水作为提取溶剂时，色谱图中未检测到芹菜素峰，且木犀草素含量相对较低。因此选择乙醇-水（85∶15）混合溶剂作为提取溶剂。

　　3.3  水解条件的确定为了准确测量旱莲草中木犀草素和芹菜素的含量,我们考察了盐酸浓度和水解时间对提取样品中所含黄酮苷元含量的影响。在上述提取条件下,考察盐酸浓度为0.08，0.16，0.24，0.32 mol·L-1对黄酮苷元含量的影响，结果当盐酸为0.24 mol·L-1时，测得的黄酮苷元含量最高。然后考察了提取液在0.24 mol·L-1盐酸中水解0.5，1，2 h对黄酮苷元含量的影响，结果水解1 h以上,黄酮苷水解基本完全。实验结果表明，最佳水解条件是提取液在0.24 mol·L-1盐酸中水解1 h。

　　3.4  提取物中木犀草素和芹菜素的存在形式黄酮类化合物在植物中大多以糖苷的形式存在［10，11］,为考察提取物中木犀草素和芹菜素的存在形式，本文对以下提取方法和“2.3”项提取法所得样品溶液的测定结果进行比较。

　　称取样品约2.0 g, 精密称定，置于圆底烧瓶中,加入25 ml石油醚浸提1 h,（加热温度：80℃）, 过滤后药渣用40 ml 85%的乙醇提取两次，每次加热回流提取2 h,过滤，合并提取液, 用旋转蒸发仪浓缩近干，将浓缩液转移至10 ml容量瓶中, 用甲醇定容,摇匀,经0.45 μm滤膜过滤,即得。

　　按此提取方法提取所得样品溶液用HPLC在相同的色谱条件检测，发现在保留时间为10.5 min和20.1 min时没有任何峰出现，说明未经酸水解的提取物中不含木犀草素和芹菜素。由此可以判定提取物中木犀草素和芹菜素几乎全部以糖苷的形式存在。

　　【参考文献】

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　　［2］ 汤海峰,赵越平,蒋永培.中药墨旱莲的研究概况［J］.西北药学杂志,1999,14(1):32.

　　［3］ 张 梅,邸晓辉,刘 梅.旱莲草中黄酮类成分的免疫调节作用［J］.中草药,1997,28(10):615.

　　［4］ 林朝朋,芮汉明,许晓春. 墨旱莲黄酮类提取物抗自由基作用及体内抗氧化功能的研究［J］.军事医学科学院院刊,2005,29（4）：344.

　　［5］ 屈凌波,王 玲,杨 冉,等.木犀草素、芹菜素与牛血清白蛋白相互作用的研究［J］.药学学报, 2006, 41(4):352.

　　［6］ 孙 斌,瞿伟菁,张晓玲.芹菜素的药理作用研究进展［J］.中药材,2004,27(7):68.

　　［7］ 王自军,薛 梅,边 丽.旱莲草中总黄酮和鞣质的超声提取与含量测定［J］.时珍国医国药,2005,16(8):759.

　　［8］ 刘 翔,曹云飞,窦金凤.不同产地墨旱莲中木樨草素含量测定［J］.中国药业,2007,16(23):12.

　　［9］ 龚先玲,陈志红,梁念慈.高效液相色谱法分析测定半边旗中黄酮类化合物［J］.时珍国医国药,2007,18(5): 1028.

　　［10］ 胡碧波,蒋惠娣,杨 俊,等.HPLC法测定不同采收期杭白菊中木犀草素及其苷的含量［J］.浙江大学学报, 2004, 33(1):29.

　　［11］ 刘金旗,吴德林,王 兰,等.菊花中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定［J］.中成药,2001,23(1):52.