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【摘要】 目的建立一种快速、高效的以非那西丁作为探针药物评价细胞色素P450 1A2（CYP1A2）酶活性的高效液相色谱-紫外检测方法。方法色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（50 mm×4.6 mm I.D.，5 μm）；流动相为乙腈-水（含0.01％七氟丁酸），梯度洗脱，流速2.0 ml·min-1；检测波长为244 nm。非那西丁与人CYP1A2酶在37 ℃温孵适当时间后，加入50 μl乙腈终止反应，10 000 g离心后取上清液进样分析测定。结果对乙酰氨基酚的保留时间为2.85 min，线性范围为1.00～200 μmol·L-1（r=0.999 9），最低定量限（LLOQ）为1.00 μmol·L-1，回收率为99.8%～102.3%；非那西丁的保留时间为3.68 min，线性范围为1.00～200 μmol·L-1（r=0.999 9），最低定量限（LLOQ）为1.00 μmol·L-1，回收率为98.3%～101.1%。两者的日内、日间相对标准偏差均小于15%，温孵体系中的其他内源性物质不干扰测定。结论该方法快速、稳定、灵敏度高，适合体外非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的测定，可应用于体外CYP1A2酶活性的评价及酶动力学的研究。
【关键词】 高效液相色谱法； 非那西丁； 对乙酰氨基酚； 细胞色素P450 1A2
Abstract：ObjectiveTo develop a method for the evaluation of cytochrome P450 1A2 activity using phenacetin as the probe compound in vitro by high-performance liquid chromatography-ultraviolet detection (HPLC-UV). MethodsAn Agilent Zorbax SB-C18 (50 mm×4.6 mm I.D., 5 μm) column was used as stationary phase. The gradient mobile phase consisted of acetonitrile and water (containing 0.01% heptafluorobutyric acid). The flow rate was 2.0 ml·min-1, and the UV detector was set at 244 nm. Firstly, phenacetin was incubated with human CYP 450 1A2 enzyme in vitro at 37℃ and stopped by addition of 50 μl acetonitrile and centrifuged (10 000 g) for 3 min. Finally, the supernatant was analyzed by RP-HPLC.ResultsThe retention time of acetamidophenol was 2.85 min. The linear calibration curves of acetamidophenol were obtained in the concentration range of 1.00～200 μmol·L-1 (r=0.999 9). The lower limit of quantification (LLOQ) of acetamidophenol was 1.00 μmol·L-1. The average recovery was 99.8%～102.3%. The retention time of phenacetin was 3.68 min. The linear calibration curves of phenacetin were obtained in the concentration range of 1.00～200 μmol·L-1 (r=0.999 9). The lower limit of quantification (LLOQ) of acetamidophenol was 1.00 μmol·L-1. The average recovery was 98.3%～101.1%. The intra- and inter-day relative standard deviations were all less than 15%. There were no endogenous substances existing in the incubation system which interference the determination of the analytes of interest.ConclusionThe method is simple, rapid and suitable for the evaluation of cytochrome P450 1A2 activity in vitro.
Key words：RP-HPLC; Phenacetin; Acetamidophenol; Cytochrome P450 1A2
细胞色素P450 1A2（CYP1A2）是最重要的P450酶之一，参与多类药物的代谢，其在人体中的表达具有组织特异性，CYP1A2主要在肝脏表达，准确地评价CYP1A2的酶活性十分重要［1～3］。咖啡因N3-去甲基代谢是常用的CYP1A2标志反应。但利用基因重组的CYP1A2酶研究发现，该反应具有双相性。只有当咖啡因≤0.1 mmol·L-1时，其代谢才能完全反映CYP1A2活性［4，5］。并且咖啡因的代谢产物难以获得，价格昂贵。因此本研究在体外CYP1A2活性研究中，选用廉价易得的非那西丁作为CYP1A2的探针底物，通过体外代谢测定其在P450酶中的代谢物对乙酰氨基酚（非那西丁O-脱乙基反应，Phenacetin O-deethylation，POD）来评价CYP 1A2酶的活性。本研究建立了快速、高效、稳定的测定CYP 450 1A2酶孵育体系中非那西丁和对乙酰氨基酚的反相高效液相色谱法，该法能同时对代谢产物及非那西丁在CYP 450 1A2酶孵育体系中代谢的酶动力学进行分析。
1 仪器与试剂
美国 Thermo Finnigan Surveyor 高效液相色谱仪；XW-80型旋涡混合器（上海第一医学院仪器厂）；TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂）；十万分之一天平（美国METTLER TOLEDO公司）。
非那西丁（批号：S4187644207B14，Sigma-Aldrich公司）；对乙酰氨基酚（批号：04203BE，Sigma-Aldrich公司）；CYP 1A2酶（批号：93824，BD GentestTM公司）；NADPH产生系统溶液A和NADPH产生系统溶液B均购于美国BD GentestTM公司。
2 方法
2.1 色谱条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱（50 mm×4.6 mm I.D.，5 μm），Agilent公司产品；流动相A为乙腈，流动相B为水（含0.01％七氟丁酸）；梯度洗脱程序为：0～0.5 min A∶B的比例为5∶95；0.5～3.5 min A∶B的比例由5∶95增加至95∶5；3.5～5.0 min A : B的比例保持95∶5不变；5.0～6.0 min A∶B的比例由95∶5恢复至5 : 95。流速2.0 ml·min-1；检测波长为244 nm；柱温30℃；进样量20 μl。
2.2 CYP 450 1A2酶的孵育实验精密吸取CYP 450 1A2酶10 μl，置于塑料离心管中，依次加入200 μl浓度为0.1 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液（pH7.4，PBS），25 μl NADPH产生系统溶液A和5 μl NADPH产生系统溶液B，再精密加入底物非那西丁对照品溶液10 μl，在37 ℃水浴中进行孵育。
2.3 样品处理在上述体系孵育适当时间后，向反应体系中加入50 μl乙腈终止反应，在10 000 g下离心3 min，取上清液进样测定。测定时，每批样品随行建立标准曲线和质控（QC）样品，这些样品须有规则地分散在待测样品的分析序列中。
2.4 对照品溶液的配制 分别精密称取非那西丁和对乙酰氨基酚对照品8.96 mg和7.71 mg，置于10 ml容量瓶中，加0.5 ml乙腈溶解，并以0.1 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液（pH7.4，PBS）稀释至刻度，即得非那西丁和对乙酰氨基酚浓度为5 mmol·L-1的对照品储备溶液。分别精密吸取上述对照品储备液适量，分别置于7个100 ml容量瓶中，用0.1 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液（pH7.4，PBS）定容，配成浓度为1.00，2.00，5.00，10.0，50.0，100和200 μmol·L-1的系列对照品溶液。
3 结果
3.1 方法的专属性对乙酰氨基酚的保留时间约为2.85 min，非那西丁的保留时间约为3.68 min，二者与非那西丁的其他代谢产物分离良好，且空白CYP 450 1A2酶孵育液中的内源性物质不干扰测定。见图1。
a空白酶孵育液 b对照品溶液 cCYP 450 1A2酶
图1 温孵后的色谱图（略）
3.2 线性关系与检测限取浓度为1.00，2.00，5.00，10.0，50.0，100和200 μmol·L-1的系列对照品溶液，除不进行孵育，并在加入CYP 1A2酶后立即加乙腈终止反应（即灭活CYP 450 1A2体系）外，其余操作均按照“2.2”项和“2.3”项下操作，并进样依法测定，分别以非那西丁和对乙酰氨基酚的色谱峰面积（Y）为纵坐标，其各自对应的摩尔浓度（X，μmol·L-1）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，求算孵育体系中非那西丁在1.00～200 μmol·L-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y= 3 358.1X-47.55（r=0.999 9）， 最低定量限（LLOQ）为1.00 μmol·L-1；对乙酰氨基酚在1.00～200 μmol·L-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y= 2767.2X+129.37（r=0.999 9），最低定量限（LLOQ）为1.00 μmol·L-1。
3.3 回收率考察取浓度为2.00，50.0和180 μmol·L-1的对照品溶液，除不进行孵育，并在加入CYP 1A2酶后立即加乙腈终止反应（即灭活CYP 450 1A2体系）外，其余操作均按照“2.2”和“2.3”项下操作，并进样依法测定，每个浓度水平测定5次，取药物含量均值计算该浓度样品的药物回收率及其相对标准偏差（RSD）。非那西丁和对乙酰氨基酚的回收率均不低于98.3％，RSD值均低于6.85％。
3.4 精密度考察取浓度为2.00，50.0和180 μmol·L-1的对照品溶液，除不进行孵育，并在加入CYP 1A2酶后立即加乙腈终止反应（即灭活CYP 450 1A2体系）外，其余操作均按照“2.2”和“2.3”项下操作，并分别在同一分析日内和连续3个不同分析日内进样，依法分析，测定日内和日间的精密度（n＝6）。结果均低于8.16％（n=6），表明方法具有良好的精密度。
3.5 稳定性考察取浓度为2.00，50.0和180 μmol·L-1的对照品溶液，除在加入CYP 1A2酶后立即加乙腈终止反应（即灭活CYP 450 1A2体系）外，其余操作均按照“2.2”项下操作，制备灭活孵育体系，置于37 ℃水浴中孵育，并分别于0、2、4、8、12、24 h取样，按照“2.3”项下操作，依法测定，结果发现各浓度的RSD均小于5.0%，表明样品中非那西丁和对乙酰氨基酚在24 h内稳定。同法将3种浓度的灭活孵育体系置于-70 ℃冰箱中保存，分别于第1，5，15，30天解冻，依法处理、测定，结果发现非那西丁和对乙酰氨基酚各浓度的RSD均小于15%，说明该样品在-70℃条件下至少稳定1个月。
3.6 非那西丁在CYP 450 1A2酶中的代谢酶动力学实验取各浓度的非那西丁（50，100，200，400 μmol·L-1）在人CYP 450 1A2酶体系中孵育，10 min后终止，按上述方法测定其中产生的对乙酰氨基酚的浓度，绘制不同非那西丁浓度（X）下产生代谢物对乙酰氨基酚的浓度（Y）曲线。结果见图2。
另取浓度为200 μmol·L-1的非那西丁，在人CYP 450 1A2酶体系中孵育，分别于5，10，20，30，40和50 min后终止反应，按上述方法测定其中产生的对乙酰氨基酚的浓度，绘制不同时间（X）产生代谢物对乙酰氨基酚的浓度（Y）曲线。结果见图3。
图2 非那西丁底物浓度与反应生成代谢物对乙酰氨基酚浓度的曲线（略）
图3 时间VS生成代谢物对乙酰氨基酚浓度的曲线图（略）
4 讨论
在非那西丁和对乙酰氨基酚测定的文献报道方法中，二者的保留时间均较长，色谱运行时间大多超过10 min。而目前分析方法研究的重点集中于在保证适当的分离效率和色谱性能的前提下能够快速地对大量样品进行分析。因此本文建立了一种反相高效液相色谱法用于快速测定CYP 1A2酶孵育体系中的非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚。本方法使用乙腈-水体系，色谱柱为较短的Agilent Zorbax SB-C18柱（50 mm×4.6 mm I.D.，5 μm），适用的流速可达2.0 ml·min-1，因此为快速的分离测定提供了基础。另外在流动相中加入七氟丁酸作为离子对试剂，以改善峰形，增加待分析物在色谱柱上的保留。
CYP 1A2酶孵育体系的预处理方法可以有固相萃取、液液提取和沉淀蛋白等方法。然而用固相萃取法进行处理，尽管能够去除大部分的内源性极性杂质，但是方法繁琐，样品量少，不适用于本研究的快速测定目的。本研究又考察了液液萃取法，考察了乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等多种溶剂的萃取效果，但由于非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的极性差别，结果发现均不能同时获得二者的较高而稳定的提取率。因此本实验最终选择沉淀蛋白法，方法极为简便，仅需加入50 μl乙腈，然后离心3 min即可同时达到终止反应和沉淀蛋白的目的，一举两得，并且色谱分析表明其中存在的内源性物质并不会影响非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的测定。
本研究建立了一种快速、灵敏、准确的人CYP1A2中非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的HPLC紫外检测法。该法适合非那西丁及其代谢物对乙酰氨基酚的定量测定，为体外CYP1A2酶活性的评价及酶动力学研究提供了方法学依据。本方法的最大优点是简单快速，色谱峰间分离效果好，每个样品的测试时间仅为5 min。因此本文所建立的方法适用于快速评价体外CYP1A2酶的活性。
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