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【摘要】 目的考察用合煎（传统汤剂）、分煎（配方颗粒汤剂）方法制备的鸭掌散汤剂中甘草酸含量的变化，并比较其体外抗菌作用。方法①建立高效液相色谱方法，采用Diamonisl C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇-0.2 mol/L醋酸胺溶液-冰醋酸（67∶33∶1）为流动相，流速1 ml/min，检测波长250 nm。分析鸭掌散合煎液和分煎液样品中甘草酸的含量变化。②采用稀释法体外测试鸭掌散不同煎液对常见菌种的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果①鸭掌散分煎液中甘草酸的平均含量大于合煎液中甘草酸的平均含量。②鸭掌散分煎液对福氏痢疾杆菌有抑菌作用，而合煎液没有；合煎液对白色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑菌作用大于分煎液。结论与传统汤剂比较，鸭掌散配方颗粒汤剂中甘草酸的含量较高，抑菌谱较广。
【关键词】 鸭掌散 甘草酸 合煎 分煎 高效液相色谱 体外抗菌
“鸭掌散”出自张时彻《摄生众妙方》，处方由麻黄、甘草、白果组成，具有敛肺定喘、化痰等功效。本实验以中药经方“鸭掌散”中的有效成分甘草酸作为指标，比较该方合煎法与分煎法制得的汤剂中甘草酸含量差异以及体外抗菌活性的差异，探索中药复方汤剂不同制法对其有效成分溶出量的影响，亦对单味中药精制颗粒应用于临床提供一些理论依据。
1 器材
1.1 仪器 安捷伦 1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，1100/ WIND3D化学工作站。
1.2 药材与试剂 麻黄为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf(河北)； 白果为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.（贵州）的干燥成熟种子；甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch(内蒙)。以上3味药材饮片经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定，按照2005版《中国药典》规定方法测定含量符合要求。
甘草酸单铵盐对照品(批号:0731-9704，中国药品生物制品检定所)；甲醇（色谱纯），醋酸胺、冰醋酸（分析纯），水（娃哈哈纯净水）。
2 方法与结果
2.1 甘草酸含量测定及比较
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Diamonisl C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2 mol/L醋酸胺溶液-冰醋酸（67∶33∶1）；流速1 ml/min；检测波长为250 nm；柱温25℃［1］。
2.1.2 溶液的制备及测定
对照品溶液的制备：精密称取甘草酸单铵盐对照品10 mg，置50 ml量瓶中，用流动相溶解并定容，即得甘草酸对照品溶液（每毫升甘草酸单铵盐对照品0.239 2 mg，折合甘草酸为0.221 mg）［1］，备用。
合煎液样品溶液的制备(传统汤剂，使用传统煎煮法) ：称取药材饮片，麻黄15.0 g，甘草12.0 g，白果10个，加8倍量的水煎煮，保持微沸30 min，倒出煎液；药渣再加8倍量的水煎煮两次，20 min/次，合并3次煎液，减压干燥成干粉。称取相当原药材处方量的干粉，置50 ml量瓶中，用开水溶解定容至刻度冷至室温。精密吸取2 ml，置25 ml容量瓶中，加流动相约20ml，超声处理（功率250 W，频率20 kHz）20 min，取出，放冷，加流动相定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用的微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
分煎液样品溶液的制备（配方颗粒汤剂，煎煮方法由贵州宏宇药业有限公司提供）：分别称取上述量的药材麻黄、甘草和白果。麻黄加10倍量的水煎煮保持微沸40 min，倒出煎液，药渣再加6倍量的水煎煮40 min；甘草加10倍量的水煎煮保持微沸60 min，倒出煎液，药渣再加8倍量的水煎煮60 min；白果加10倍量的水煎煮保持微沸60 min，倒出煎液，药渣再加8倍量的水煎煮40 min；分别合并各药材的两次煎液，减压干燥成干粉。将各药材干粉混合均匀，称取相当原药材处方量的干粉，同合煎液样品溶液制备法制得分煎液样品溶液。
阴性对照液的制备：再分别按上法制备不含甘草的合煎液、分煎液的阴性对照液。
2.1.3 线性关系考察标准曲线的绘制：分别精密称取甘草酸单铵盐对照品，用流动相稀释配制浓度分别为0.044 2，0.088 2，0.132 4，0.176 2，0.221 1，0.266 4 mg/ml的甘草酸单铵盐系列对照品溶液，精密吸取甘草酸单铵盐系列对照品溶液10 μl，按上述色谱条件依次测定峰面积，以峰面积积分值（A）对进样量（C）进行线性回归，得回归方程为A=710.033 0C+2.966 8，r=0.999 9。甘草酸在0.442～2.664 μg间浓度与峰面积的线性关系良好。
2.1.4 精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 μl，重复进样6次，测定相应峰面积，RSD = 0.2%。
2.1.5 稳定性实验取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h测定，合煎液RSD = 1.1%；分煎液RSD = 1.1%，表明两种供试品溶液在8 h内稳定。
2.1.6 重复性实验 分别取同一样品干粉各6份，按相应样品液处理方法制备及测试条件测定，结果合煎液RSD = 0.4%，分煎液RSD = 1.2%。
2.1.7 回收率实验精密称取已知含量的合煎液样品和分煎液样品干粉各9份，分别加入3个不同浓度的甘草酸单铵盐对照品，按上述条件各制备9份供试液，稀释到25倍进行加样回收，过0.45 μm滤膜，并按色谱条件项下进样，同法测定。结果见表1～2。表1 分煎汤剂甘草酸加样回收测定结果 表2 合煎汤剂甘草酸加样回收测定结果
2.1.8 样品含量测定 精密吸取同体积的合煎液、分煎液，按上法分别平行测定5次，求平均样品含量。甘草酸在鸭掌散每个复方中的含量分别为合煎105.22 mg，分煎116.03 mg。
2.2 体外抗菌实验
2.2.1 实验菌种、培养基与仪器 金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、白色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、青霉菌，由贵阳中医学院微生物检测室提供。
普通肉汤培养基、普通营养琼脂、血琼脂平板、沙氏琼脂培养基、沙氏液体培养基等。
Ⅱ级生物安全柜、生化培养箱。
2.2.2 方法及结果
菌株及药物的处理：将上述细菌菌株分别用相应培养基常规转种培养24 h后，再用液体传代培养6 h，然后作1∶1 000稀释备用。黑曲霉菌和青霉菌用暴皿法收集培养，洗脱孢子，调整浓度为2×105个/ml备用。
取适量鸭掌散合煎液干粉加入50 ml容量瓶中，加开水至刻度，摇匀，配成浓度相当于1g药材/ml的合煎液溶液。
取适量鸭掌散分煎液干粉加入50 ml容量瓶中，加开水至刻度，摇匀，配成浓度相当于1g药材/ml的分煎液溶液。
抗菌强度定性实验：采用常规琼脂扩散管碟法定性测定该药的抗菌强度(接种试验菌液0.1 ml，药物用上述100%浓度原液，药物量200 μl)。结果见表3。
抗菌强度定量实验（采用试管法定量测定抗菌强度）：每一菌株取干净试管10支，于第1管加入上述100%浓度药液和相应培养液1ml，第2管至第8管各加入相应培养液1 ml。将第1管中药液混匀后沿2～8管做等倍稀释，至第8管混匀后吸取1 ml弃去，由此得到1∶2，1∶4，1∶8……1：256的稀释度。第9管只加稀释菌液1.05ml作阳性对照，第10管只加相应培养液1.05 ml作阴性对照。分别吸取稀释菌液0.05 ml加入第1管至第8管，混匀。常规培养结果见表3。表3 抗菌强度定性、定量实验结果
3 讨论
采用HPLC法测定中药复方制剂中的甘草酸，文献报道可用多种不同组成的流动相系统［2，3］，本实验选择药典方法，甘草酸在13.5～15.5 min之间出峰，并与杂质峰能达到基线分离。
鸭掌散有敛肺定喘，化痰等功效，甘草有抗菌活性。因此，对鸭掌散合煎汤剂与分煎汤剂进行了甘草酸含量和体外抗菌活性的对比研究。从以上研究结果可以看出，与鸭掌散合煎液相比较，分煎液中甘草酸的含量较高。合煎液中的有效成分含量低是否是一个比较普遍的现象，还有待更深入广泛的研究才能确定。
根据以上结果，合煎液对白色葡萄球菌、黄曲霉菌的抑菌作用略大于分煎液。分煎液对福氏痢疾杆菌有抑菌作用，而合煎液没有，是否在混合煎煮过程中有某化学成分起抑制作用，两种汤剂对不同细菌抑菌的差异还需要进一步的实验研究。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会.中国药典，I部［S］.北京:化学工业出版社,2005：59.
［2］ 白 丽,陈晓辉,徐新盛,等.HPLC测定萆薢分清丸中甘草酸的含量［J］.中成药, 2005,27(8):981.
［3］ 祈大庆,胡秀波.HPLC法测定痰咳净片中甘草酸的含量［J］.浙江化工,2005,36(7):33.