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【摘要】 目的建立甘草苷和甘草酸的HPLC含量测定方法。方法使用KromasiL-C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸(20:80)为流动相，检测波长276 nm，柱温为室温；甘草酸流动相为甲醇-0.2 mol·L-1乙酸铵溶液-冰乙酸(67∶32∶1)，检测波长252 nm，柱温为室温。二者流速均为1.0 ml·min-1，采用外标法定量测定。结果甘草苷在2.7～27 μg·ml-1范围内呈良好线性关系（r=0.999 7）；甘草酸在6～36 μg·ml-1范围内呈良好线性关系（r=0.999 8）；甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为101.4%和101.3%，其RSD值分别为1.18%和1.22%。结论该方法操作简便、准确，线性相关系数良好，且稳定性和重复性好，适用于甘草黄酮粗提物及纯化物中甘草苷和甘草酸的含量测定。
【关键词】 高效液相色谱； 甘草苷； 甘草酸
Abstract：ObjectiveTo establish method for determination of liquiritin and glycyrrhizic acid by HPLC.MethodsKromasil-C18 column(4.6 mm×200 mm,5 μm)was used, HPLC analysis for liquiritin was performed with room temperature and the mobile phase consisted of acetonitrile-0.5% glacial acetic acid(20∶80),the detection wavelength was at 276 nm; HPLC analysis glycyrrhizic acid was performed with room temperature and the mobile phase consisted of methanol-0.2 mol·L-1 ammonium acetate-glacial acetic acid(67∶32∶1), the detection wavelength was at 252 nm. The flow rate was 1.0 ml·min-1. ResultsThe linear range of liquiritin was obtained between 2.7～27μg·ml-1 (r=0.9997); the linear range of glycyrrhizic acid was obtained between 6～36μg·ml-1 (r=0.999 8); the average recovery of liquiritin and glycyrrhizic acid were 101.4% and 101.3% respectively with corresponding RSD of 1.18% and 1.22%. ConclusionThis method is simple, convenient stable,repeatable and accurate with good linear relationship. It is suitable for the determination of liquiritin and glycyrrhizic acid in extraction and purification of licorice flavonoid.
Key words：HPLC； Liquiritin； Glycyrrhizic acid
甘草是新疆蕴藏量大、药用价值高的一种荒漠草原药用植物，其主要有效成分为甘草酸和黄酮类化合物。甘草黄酮具有明显的抗肿瘤、抗溃疡、抗菌、抗变态反应、降血脂和镇痛的作用，并对爱滋病病毒有很强的抑制增殖作用［1，2］，是甘草有效成分开发的热点。经典的黄酮含量测定方法，是以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定［3～5］，但此方法用于甘草黄酮的测定尚有诸多不足之处。甘草黄酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黄酮内在质量的一个重要指标［6］。本研究以甘草苷为对照品，采用HPLC法测定甘草黄酮含量的方法，同时研究优化以HPLC测定甘草酸含量的方法，以期为甘草有效成分的综合开发利用和质量监控提供新的方法和思路。
1 仪器与材料
1.1 仪器 LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)；SPD-10A可变紫外检测器(日本岛津)；万分之一天平（Sartorius）；KQ-250B型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。
1.2 材料 甘草(石河子天德中药厂)。甘草苷对照品、甘草酸单铵盐对照品(均购自中国药品生物制品检定所)；95%乙醇(A.R)、冰醋酸(A.R)、乙酸胺(A.R)、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）。
2 方法与结果
2.1 色谱分析条件
2.1.1 甘草苷检测条件色谱柱为KromasiL-C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.5%醋酸(20∶80)；紫外检测波长：276 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温为室温；进样量20 μl。理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于4 000。对照品和甘草黄酮粗提物的色谱图见图1～2。
2.1.2 甘草酸检测条件色谱柱为KromasiL-C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.2 mol·L-1乙酸铵溶液-冰醋酸(67∶32∶1)；紫外检测波长252 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温为室温；进样量20 μl。理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于2 000。对照品和甘草黄酮粗提物分离的色谱图见图3～4。
2.2 对照品及供试品溶液的配制
2.2.1 对照品溶液的配制 取甘草苷和甘草酸单铵盐对照品适量，精密称定，用流动相配制成浓度为54 μg·ml-1的甘草苷对照品溶液和120 μg·ml-1的甘草酸单铵盐对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取甘草黄酮提取物适量，用相应的流动相溶解，定溶于10 ml量瓶中,作为甘草苷供试品溶液。
精密称取甘草黄酮提取物适量，用相应的流动相溶解，定溶于10 ml量瓶中，作为甘草酸供试品溶液。
2.3 检测波长的选择 以流动相为参比溶液，在200～400 nm波长范围内分别对甘草苷和甘草酸对照品溶液进行扫描，结果表明，甘草苷在276 nm处有一最大吸收峰，甘草酸在252 nm处有一最大吸收峰，所以选定276 nm为甘草苷的检测波长，252 nm为甘草酸的检测波长。
2.4 线性关系的考察精密吸取甘草苷对照品储备液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml于10 ml量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，摇匀；再精密吸取甘草酸单铵盐对照品储备液0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 ml于10 ml量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀；分别按“2.1”项色谱条件进行测定，以峰面积A（μV·s）对进样浓度C（μg·ml-1）作回归统计，结果：甘草苷在2.7～27μg·ml-1范围内线性良好，回归方程：A=24 962C+7161.1，r=0.999 7。
甘草酸在6～36 μg·ml-1范围内线性良好，回归方程为：A=23 653C+23 125，r=0.999 8。
2.5 精密度实验取同一供试品溶液，重复进样6次，求得甘草苷的RSD为0.74%，甘草酸的RSD为0.92%，说明本方法精密度良好。
2.6 重复性实验按“2.2.2”项制备同一批号供试品溶液6份，按拟定的色谱条件分别测定甘草苷和甘草酸的含量，测得甘草苷的RSD为1.32%，甘草酸的RSD为1.04%，表明重复性较好。
2.7 稳定性实验配制同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10，12，24，36，48 h后进样，求得甘草苷的RSD为1.44%，甘草酸的RSD为0.89%，表明样品溶液在48 h内稳定。
2.8 回收率实验取已知含量的同一供试品溶液各5份，分别精密加入同一浓度同一体积的甘草苷对照品溶液，甘草酸单铵盐对照品溶液，混匀，进样，按上述方法测定甘草酸和甘草苷的含量，测得甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为101.4%，101.3%；RSD值分别为1.18%，1.22%。表明本实验所确定的HPLC法进行甘草苷和甘草酸的含量分析，准确度较高。结果见表1。 表1 甘草酸和甘草苷的回收率实验结果
2.9 样品测定分别精密称定甘草黄酮粗提物和纯化物各3份，适量，按“2.2.2”项方法制备所需的供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件分别测定甘草苷和甘草酸的峰面积，计算甘草黄酮粗提物（烘干样）中甘草苷和甘草酸的纯度分别为3.68%和18.38%，甘草黄酮纯化物（烘干样）中甘草苷的纯度为17.29%，未检测到甘草酸。结果见表2。甘草黄酮纯化物分离的色谱图见图5。 表2 样品测定结果
测定项甘草黄酮粗提物123平均值RSD甘草黄酮纯化物123平均值RSD甘草酸纯度18.2518.5118.3918.380.71-----甘草苷纯度3.623.733.693.681.5117.1617.3117.4017.290.70
“-”为未检测到
3 讨论
3.1 甘草苷流动相的选择 考察了选用不同比例的乙腈-0.5%醋酸为流动相时对甘草苷的保留时间及分离度的影响。 实验结果表明，以乙腈-0.5%醋酸（10∶90）为流动相时，保留时间短，但峰形较差，乙腈比例增大后峰形变得较尖锐对称，响应值显著增大，分离度逐渐改善，保留时间先增大后缩短，当乙腈比例大于20%后，未检测到甘草苷，综合考虑，选用乙腈-0.5%醋酸（20∶80）为流动相，甘草苷的保留时间适中，分离效果好。
3.2 甘草酸流动相的选择 本实验分别选用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2 mol·L-1乙酸铵溶液-冰醋酸(67∶32∶1)为流动相，实验结果表明，甲醇-2%乙酸（73∶27）和甲醇-0.2 mol·L-1乙酸铵溶液-冰乙酸(67∶32∶1)为流动相时，分离效果均较好，但在流动相的稳定性和分析时间的合理性方面，后者更优越，因此选用甲醇-0.2 mol·L-1乙酸铵溶液-冰醋酸(67∶32∶1)为流动相。
按本法分别对甘草苷和甘草酸进行高效液相色谱分析，具有回收率和线性相关系数良好，操作简便，快速，样品用量少，精密度和重复性好，自动化程度高等优点，适用于甘草黄酮粗提物及纯化物中甘草苷和甘草酸的质量控制，具有广泛的应用前景。
【参考文献】
［1］ 邢国秀，李 楠，王 童，等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展［J］.中国中药杂志，2003，28(7)：593.
［2］ 从景香，高丽娟，林炳昌，等.甘草黄酮类化合物研究进展［J］.精细化工，2004，21(10)：121.
［3］ 徐 剑，袁如彩，秦延年.银杏叶黄酮口服液的质量控制方法［J］.徐州医学院学报，1998，18（3）：256.
［4］ 卢元芳，宫 霞.银杏叶黄酮类化合物的提取和药理作用［J］.曲阜师范大学学报，1999，25（3）：95.
［5］ 封士兰.甘草黄酮的提取分离和含量测定［J］.兰州医学院学报,1998,24（4）：20.
［6］ 伍尉萍，阎宏涛，孙文基.HPLC法测定甘草中甘草苷的含量［J］.药物分析杂志，2004，24（4）：425.