高效液相色谱法测定木瓜片中欧前胡素的含量

　　【摘要】  目的建立木瓜片中欧前胡素的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法。方法色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相为甲醇-水（59∶41）；流速1.0 ml/min；波长248 nm，柱温30℃。结果欧前胡素线性范围为 5.64～56.4 mg（r=0.999 4）；平均回收率分别为97.8% （RSD为1.65%）。结论所建定量方法专属性强，重复性好，可为木瓜片的质量控制方法。

　　【关键词】  木瓜片; 欧前胡素; 高效液相色谱法; 白芷

　　Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard for Mugua Tablets. MethodsThe content of Imperatorin was determined by HPLC. The chromatographic column was an Agilent Eclipse XDB C18 (4.6 mm×250 mm, 5 mm), the mobile phase was methanol-water (59∶41), the detection wavelength was 294 nm, the flow rate was 1.0 ml/min, and the column temperature was 30℃.  ResultsThe linear ranges of imperatorin were with in the range of  5.54 to 56.4mg  (r=0.999 4). The average recovery was 97.8% (RSD was 1.65 %) . ConclusionThe HPLC method is exclusive, reproducible and suitable for the quality control of Mugua Tablets.

　　Key words：Mugua Tablets;  Imperatorin;   HPLC;   Radix Angelicae Dahuricae

　　木瓜片收载于部颁药品标准(WS3-B-1890-95)，由木瓜、当归、川芎、白芷等12味中药材组成，主要用于风寒湿痹，四肢麻木，周身疼痛，腰膝无力，步履艰难。白芷为本方中的主药之一，所含化学成分以挥发油、香豆素类为主，具有散风除湿，通窍止痛，消肿排脓之功效［1］。现代药理实验表明白芷中所含欧前胡素为其重要活性成分之一，多采用HPLC法测定其含量来控制白芷药材［1～3］及其成药质量［4,5］。本品在原部颁标准中无含量测定方法，因此本实验建立高效液相色谱法测定欧前胡素的含量，可以更有效地控制该成药的质量。

　　1  器材

　　Waters 2695高效液相色谱仪，配置自动进样器、2996二极管阵列检测器、柱温箱。甲醇（色谱纯，美国Fisher），超纯水（millipore）；其它试剂为分析纯。

　　欧前胡素对照品（中国药品生物制品检定所，批号为11826-200410）。

　　木瓜片样品由天津中新药业集团隆顺榕制药厂提供（批号为：060801，060802，060803）。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件  色谱柱为Agilent Eclipse  XDB C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相为甲醇-水（59∶41）；流速1.0 ml/min；波长248 nm，柱温30℃；进样量10 μl。

　　2.2  对照品溶液的制备  精密称取欧前胡素对照品7.5 mg，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1  ml，置50 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升含欧前胡素3 μg）。

　　2.3  供试品溶液的制备  取本品适量，研细（过80目筛），取2 g，精密称定，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理60 min，放冷，过滤，蒸干，用少量甲醇洗涤容器，合并滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解转移至10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

　　2.4  阴性样品溶液的制备按处方取除白芷外的其他各味药材，按木瓜片的制备工艺制得阴性样品，再按供试品溶液的制备方法，制得阴性样品溶液。

　　2.5  专属性实验  分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，采用“2.1”项色谱条件注入高效液相色谱仪，HPLC图谱见图1。结果表明处方中其它成分对欧前胡素含量测定无干扰。

　　2.6  线性范围  精密吸取的欧前胡素（浓度为2.82 μg/ml）对照品溶液2，4，6，8，10，12，20 μl，注入液相色谱仪，按实验色谱条件分析，测定各自峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，求得回归方程：Y = 5 261.4X - 2 946.9，相关系数r= 0.999 4。结果表明欧前胡素在5.64～56.4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.7  精密度实验  取同一供试品溶液重复进样6次，欧前胡素的峰面积的RSD为1.01%(n=6)。

　　2.8  稳定性实验取同一供试品溶液分别在0，2，4，8，16 h进行测定，欧前胡素的峰面积的RSD分别为1.15%，表明样品在16 h内稳定。

　　2.9  重复性实验   取同一批号样品6份，按供试品溶液制备方法制备，并按“2.1”项色谱条件测定，结果欧前胡素的含量的RSD分别为0.87%。

　　a-欧前胡素对照品  b-木瓜片样品  c-木瓜片缺白芷阴性样品

　　图1  HPLC图谱

　　2.10  加样回收实验  取重复性实验同一批号样品，取1 g（共6份），精密称定，分别加入欧前胡素（0.50 μg/ml）对照品溶液各25 ml，称定重量，再按照供试品溶液制备操作，制成供回收率用供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分析，测定样品中含量，计算回收率。结果见表1。表1  欧前胡素加样回收率实验结果

　　2.11  样品测定取3批样品，按供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取欧前胡素对照品溶液与3批供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分析，以外标法计算欧前胡素的含量。结果见表2。表2  含量测定结果

　　2.12  不同色谱柱及不同仪器对含量测定的影响

　　2.12.1  不同色谱柱对含量测定的影响取同一批号样品，按供试品溶液制备方法平行制备两份，分别用Agilent Eclipse XDB，Dikma色谱柱，采用Waters 2695高效液相色谱仪，按上述色谱条件分析，测定样品中欧前胡素含量。结果见表3。表3  不同色谱柱对含量测定的影响μg·g-1

　　2.12.2  不同仪器对含量测定的影响取同一批号样品，按供试品溶液制备方法平行制备两份，用Agilent Eclipse XDB色谱柱，分别采用Waters 600与Waters 2695高效液相色谱仪，按上述色谱条件分析，测定样品中欧前胡素含量。结果见表4。

　　表4  不同仪器对含量测定的影响μg·g-1

　　仪器欧前胡素含量12平均值Waters2695 16.4116.4816.44Waters60017.05 17.2117.13

　　n=2

　　结果显示，采用相同仪器，不同色谱柱，与采用相同色谱柱，不同仪器对测定对检验结果均无影响。

　　3  讨论

　　经二极管阵列检测器190～400 nm扫描，欧前胡素紫外扫描图见图2。由图2可以看出欧前胡素分别在192，217，248 nm和301 nm四个波长有吸收，但考虑到在测定过程中使用甲醇作为流动相，在低波长有紫外吸收，而301 nm响应不如248  nm，因此检测波长选择为248 nm。

　　图2  欧前胡素紫外扫描图

　　本实验采用了超声处理的方法，考察了不同提取时间(4，60，75 min) 对含量测定的影响；结果表明，选择超声提取60 min欧前胡素已提取完全。

　　在色谱系统的选择中，先后试验了甲醇-水(55∶45)、乙腈-水（55∶45）等流动相系统，试验发现，欧前胡素与其它组分峰未能较好地分离。因此在试验其它色谱条件中将水相比例调低并考虑成本问题，最终确定甲醇-水（59∶41）为本实验流动相系统，分离情况较好，峰纯度符合要求。

　　利用高效液相色谱法测定木瓜片中欧前胡素的含量,所测结果重复性、精密度较好，具有灵敏、准确、快速的特点,有利于药品质量的控制,确保药物的临床疗效。

　　【参考文献】

　　［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：69.

　　［2］ 孟兰贞，聂 红，徐珍夏，等. 色谱技术在中药白芷研究中的应用进展［J］.时珍国医国药, 2006,17(1):4.

　　［3］ 贾敏如, 王梦月, 金曲嫫, 等. HPLC测定13种白芷中欧前胡素和异欧前胡素的含量［J］.华西药学杂志, 2003,18(5):361.

　　［4］ 毛彦杰, 岳 敏, 谷学新, 等. HPLC测定清眩丸中欧前胡素的含量［J］.中成药, 2005,27(5):618.

　　［5］ 赵春香, 梁 英, 王丽娜. HPLC法测定鼻炎灵片中欧前胡素的含量［J］.中草药, 2004,35(6):642.