高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸的含量

　　【摘要】  目的建立金银花提取物中绿原酸含量的HPLC测定方法。方法国产C18柱（4.6 mm×250 mm,7 μm）;流动相为乙腈：0.4%磷酸（12∶88）；检测波长为327 nm；流速1 ml·min-1；进样量10 μl；柱温25℃。结果绿原酸在0.071 6～0.644 4 μg范围内线性关系良好，r=0.999 6；平均回收率99.99%，RSD=1.61%（n=6）。结论该方法简便、快速、准确，可用于金银花提取物的含量测定及质量控制。

　　【关键词】  金银花提取物； 绿原酸； 高效液相色谱法

　　AbstractObjectiveTo establish a method for the determination of Chlorogenic acid in the extract of Flos Lonicerae.MethodsThe chromatographic conditions were as follows: C18 chromatographic column (4.6 mm×250 mm,7 μm)，a mobile phase of acetonitrile and 0.4% H3PO4(12:88)，the detection wavelength at 327 nm and the flow rate being 1 ml·min-1.  ResultsA linearity of Chlorogenic acid in the extract was obtained in the range of 0.071 6～0.644 4 μg r=0.999 6(n=6).The average recovery was 99.99% and RSD=1.61%(n=6). ConclusionThis method is easy, sensitive and accurate for the determination of Chlorogenic acid in the extract of Flos Lonicerae.

　　Key wordsChlorogenic acid;    HPLC;   Determination

　　金银花Flos Lonicerae又名忍冬、双花 ，为临床常用中药 ,具有清热解毒、凉散风热之功效 ，主治痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等［1］。在中成药中，金银花或以细粉直接入药，或以提取物的形式入药，但大部分制剂以后者的形式入药，但即使以后者入药，也有两种形式，一是以全草直接投料,煎煮入药，即以煎煮液(即药材的提取液)作为半成品(中间体)；另一种是先提取有效部位，而后以提取物投料，即以提取物作为中间体(原料)（刘艳娥《第二军医大学硕士学位论文》）。为了有效控制金银花提取物（中间体）的内在质量，本实验参考了有关文献［2，3］及2005版《中国药典》［4］方法，采用高效液相色谱法测定金银花提取物中绿原酸含量。

　　1  仪器与试药

　　Agilent 1100 series 高效液相色谱仪（G1322A排气阀，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器），chemistation 色谱工作站，Kromasil C18色谱柱，超声提取器（KQ3200DE型数控超声仪昆山市超声仪器有限公司）；绿原酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，批号110753-200212)，金银花提取物（本实验室自制）， 乙腈，磷酸均为分析纯；水为双蒸水。

　　2  方法与结果［5］

　　2.1  分析方法的建立——分离及检测条件的选择

　　2.1.1  色谱条件 色谱柱为国产Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，7 μm）； 柱温25℃; 流动相为乙腈-0.4% 磷酸(12∶88)；流速为1 ml·min-1；检测波长327 nm。

　　2.1.2  pH值对峰形的影响 绿原酸属于有机酸类物质，在HPLC测定时易发生前沿或拖尾峰，流动相加入酸可以改善这种现象。本实验比较了水、乙酸、磷酸对峰形的影响，当选用0.4%磷酸时，可得到较好的色谱峰形。

　　2.1.3   色谱系统适应性实验 在选定条件下，绿原酸和样品中其他组分可基线分离，绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数（N）为5 000以上。结果见图1。

　　a-对照品      b-供试品

　　图1  金银花提取物HPLC图谱

　　2.2   对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含35.8μg的溶液，即得。2.3   供试品溶液的制备 精密称取本提取物10 mg，置100 ml容量瓶中，双蒸水溶解，超声2 min后，再用双蒸水定容至刻度，摇匀，过0.45 μg微孔滤膜，取续滤液即得。

　　2.4  线性范围的考察及其标准曲线的绘制  精密吸取对照品溶液2， 4，6，10，14，18μl，分别注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值（A）对进样量进行回归，得回归曲线方程：Y =2 468.4X - 16.205，r=0.999 6。结果表明，绿原酸在0.071 6～0.644 4 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。结果见图2。

　　图2  绿原酸标准曲线

　　2.5  精密度实验  精密吸取对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复进样6次，记录各组绿原酸峰面积值，结果平均峰面积为：840.5，RSD为0.69%（n=6）。

　　2.6  稳定性实验  取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h进样10μl，测得绿原酸的平均峰面积值为：680.24，RSD为：0.38%（n=5），表明供试品溶液在8 h内稳定。

　　2.7  重复性实验  取同一批号（070204）样品6份，按含量测定方法测定，结果绿原酸平均含量为28.01%，RSD为1.07%（n=6）。

　　2.8  加样回收率实验  精密称取已知含量的金银花提取物6份，分别精密添加绿原酸对照品适量，按供试品溶液的方法制备，测定，计算回收率。结果见表1。表1  加样回收率实验结果

　　2.9  样品测定  取3批样品，按照上述方法制备供试品溶液，进样10μl，依照已确定的色谱条件测定，按峰面积值用外标法计算样品中绿原酸的含量。结果见表2。表2  样品含量测定结果

　　3  讨论

　　金银花提取物以有机酸为有效成分，本实验以绿原酸含量作为金银花提取物的质量控制指标，同时测定了3批金银花提取物中绿原酸的含量，通过计算，其含量均在20%以上。本文所建立的方法简便、快捷，重复性及稳定性均较好，可在实际生产中用于该提取物的质量控制。本文所做的工作为开发金银花的相关产品提供了质量监控方法。

　　【参考文献】

　　［1］ 于生兰，张 龙，孙 玲.金银花的研究进展［J］.时珍国医国药，2002，13（8）：498.

　　［2］ 李喜香，杜景云，吴玲燕. HPLC法测定附炎清灌注液中绿原酸的含量［J］.中药新药与临床药理，2004，15（1）：48.

　　［3］ 邓 良,袁 华,喻宗沅.绿原酸的研究进展［J］.化学与生物工程，2005，7：4.

　　［4］ 国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：152．

　　［5］ 刘恩荔，李青山.高效液相色谱法测定金银花有效部位中绿原酸的含量［J］.山西医科大学学报，2006，37（2）：166.