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高效液相色谱法测定五虎散中羟基红花黄色素A的含量

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摘要:【摘要】目的建立复方制剂五虎散中红花有效成分的高效液相色谱测定方法。结果羟基红花黄色素的线性范围分别为0。结论该测定方法简便可行、重复性好,可用于该制剂中红花有效成分的含量测定。羟基红花黄色素。...

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  【摘要】 目的建立复方制剂五虎散中红花有效成分的高效液相色谱测定方法。方法采用Agilent C18(5 μm,250 mm×4.60 mm)色谱柱;以甲醇-0.4%磷酸水(33∶67)为流动相,流速为1 ml·min-1,检测波长为402 nm。结果羟基红花黄色素的线性范围分别为0.056 5~0.452 μg(r=0.999 4),平均加样回收率(n=6)为99.15%, RSD为4.51%。结论该测定方法简便可行、重复性好,可用于该制剂中红花有效成分的含量测定。

  【关键词】  五虎散; 羟基红花黄色素; 高效液相色谱

  Abstract:ObjectiveTo establish the method for determination of effective components in Wuhu powder by RP-HPLC. MethodsThe contents of hydroxysafflor yellow A was determined by an HPLC system using following conditions: the column was Agilent C18(5 μm, 250 mm×4.60 mm), with CH3OH-0.4% H3PO4water solution(33:67)as mokile phase, the flow  rate was 1.0 ml·min-1, the detection wavelength was at 402 nm. ResultsThe linear range of hydroxysafflor yellow A was 0.056 5~0.452 μg(r= 0.999 4); its average recovery were 99.15%, corresponding RSD were 4.51%. Conclusion The HPLC method is simple, accurate, highly selective and reproducible, thus it can be used as quality control of Compound Wuhu powder.

  Key words:Wuhu powder;   Hydroxysafflor yellow A;   HPLC

  五虎散是《中国药典》收载的品种,由当归、红花、防风、天南星(制)和白芷等5味中药组成,具有活血散淤、消肿止痛作用,用于跌打损伤、淤血肿痛等。法定标准[1]中仅收载了显微鉴定和当归、白芷的TLC定性鉴别。未有含量测定标准。该制剂的疗效确切,在医院广泛使用。为建立五虎散的含量测定方法,笔者采用了HPLC法测定五虎散中羟基红花黄色素A,并对其含量测定方法进行了系统研究,现报道如下。

  1  器材

  1.1  仪器BS124S型电子分析天平(德国Sartorius);Agilent1100型高效液相色谱仪。

  1.2  试剂甲醇(色谱纯,Merck公司),超纯水,甲醇(分析纯)。

  1.3  样品五虎散(医院制剂室生产,批号为20060801  20060803  共两批)。

  1.4  对照品羟基红花黄色素A (批号∶111637-200502),对照品购自中国药品生物制品检定所。

  2  方法与结果

  2.1   Agilent C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:甲醇-0.4%磷酸水溶液(33∶67);流速为1 ml·min-1,检测波长为402 nm;柱温:室温;进样量10 μl。在该色谱条件下,羟基红花黄色素A能够达到基线分离,其他成分对测定无干扰。结果见图1。

  2.2  样品的制备

  2.2.1  供试品溶液的制备  精密称取五虎散粉约1 g,置于10 ml具塞三角瓶中,准确加入pH为2的95%乙醇5 ml,称重,超声30 min,室温放置20 min后,以pH为2的95%乙醇补足损失的重量,摇匀,过滤。取续滤液过0.45 μm微孔滤膜,即得。

  a-对照品羟基红花黄色素A  b-五虎散样品  c-缺红花阴性样品

  图1  羟基红花黄色素A的HPLC图谱

  2.2.2  对照品溶液的制备  精密称取对照品羟基红花黄色素A适量,配制成每毫升中含羟基红花黄色素A 0.565 mg的对照品溶液。

  2.3  线性关系  分别吸取对照品溶液1,2,4,6,8 μl注入高效液相色谱仪,按色谱条件测定。以各对照品进样量(Y)对峰面积(X)进行线性回归处理,结果显示,羟基红花黄色素A进样量在0.056 5~0.452 μg范围呈线性关系,回归方程为Y=1 870X+12.57,相关系数r=0.999 4。

  2.4  精密度实验  精密吸取上述对照品溶液5μl,连续进样6次,测得羟基红花黄色素A峰面积平均值为536.95,RSD为3.52%。表明分析方法精密度良好。

  2.5  稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10μl分别在0,1,3,4,5,6 h按上述色谱条件测定6次,结果羟基红花黄色素A的平均峰面积为0.280 4,RSD为3.60%。表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

  2.6  重复性实验  取同一批号样品(20030801),按供试品溶液制备项下操作,平行制备6份,按色谱条件测定百分含量(%),羟基红花黄色素A的平均含量为0.164 1 mg·g-1,RSD为5.0%。表明分析的重复性良好。

  2.7  加样回收率实验  精密称取已知含量的五虎散粉(20030801)0.5 g,分别精密加入一定量的羟基红花黄色素A对照品,按供试品溶液制备项下操作,重复操作6份,按色谱条件测定含量,计算回收率。结果见表1。表1  羟基红花黄色素A回收率实验结果

  3  样品测定

  精密称取活血通络片粉约1 g(同一批号称取3个样品,然后算出平均值作为结果),按样品制备方法制备供试品溶液,分别精密吸取对照品溶液4 μl与样品供试液各10 μl,按上述拟定的色谱条件测定,结果见表2。表2  样品测定结果mg·g-1

  4  讨论

  本实验曾采用乙腈-水系统、甲醇-水系统的不同梯度为流动相,结果以文中条件分离效果好,重现性强,被检成分均达到基线分离,理论塔板数均在10 000以上。

  该分析方法是在《中国药典》收载的红花含量测定方法[1]上加以改进的方法。 但我们注意到在该分析过程中,应注意控制柱温在25℃。柱温过高将影响羟基红花黄色素A分离度与峰的对称性。

  羟基红花黄色素A受热不稳定,故该提取方法宜采用短时间超声提取。实验发现超声时间过长,羟基红花黄色素A的含量下降显著。同时由于各批次原药材的有效成分含量不同,引起成品含量的波动,我们应在生产前,严格控制原药材的质量与含量。

  【参考文献】

  [1] 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京:化学工业出版社,2000:119,388.

 

作者: 未知
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