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【摘要】 目的建立HPLC法测定磷酸川芎嗪纳米脂质体中磷酸川芎嗪的含量。方法色谱柱为phenomenex Luna C18(2)100A(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱，phenomenex 保护柱;流动相为甲醇-水(3∶2)；流速1.0 ml/min；检测波长295 nm；柱温为室温。结果磷酸川芎嗪与辅料及溶剂峰分离良好，在0.408~40.8 μg/ml 浓度范围内线性关系良好(r=0.999 9)。结论该方法简便易行，准确可靠，可用于磷酸川芎嗪纳米脂质体的含量测定。
【关键词】 磷酸川芎嗪 纳米脂质体 高效液相色谱
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of the content of tetramethylpyrazine phosphate (TMPP) in TMPP nanoliposome. MethodsThe condition of HPLC was as follows: phenomenex Luna C18(2)100A column(4.6 mm×250 mm,5 μm), mobile phase: methanol/water (3∶2) and wavelength:295 nm. The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was room temperature. ResultsThere was good relation between TMPP and the excipients under this chromatographic condition． The calibration curve was linear in the range of 0.408~40.8 μg/ml(r=0.999 9).ConclusionThe method is simple and accurate. It can be used for the determination of content of tetramethylpyrazine phosphate nanoliposome．
Key words：Tetramethylpyrazine phosphate(TMPP); Nanoliposome; HPLC
川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)是中药川芎中的主要活性生物碱，临床上广泛用于缺血性脑血管病的治疗。已上市的川芎嗪制剂主要有磷酸川芎嗪(Tetramethylpyrazine phosphate，TMPP)片剂、胶囊剂和注射剂［1］。口服制剂生物利用度不高；注射剂给药不方便。有研究报道，川芎嗪鼻腔吸收良好［2］。作者拟将川芎嗪研制成纳米脂质体进行鼻腔给药，以期为川芎嗪的临床应用提供一个方便有效的新给药系统。为控制其质量，本研究采用HPLC法测定磷酸川芎嗪纳米脂质体中磷酸川芎嗪含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器Summit P680型高效液相色谱仪，包括p682泵、UVD170U可变波长紫外检测器、Chromeceon色谱工作站，德国dionex公司；AUY220型电子天平，Shimadzu公司；phenomenex Luna C18(2)100A(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱，phenomenex 保护柱，广州菲罗门科学仪器有限公司。
1.2 药品与试剂 磷酸川芎嗪，批号：050814，广东丽珠集团利民制药厂；大豆磷脂EPIKURON 200，批号：1-5-9022（德国Degussa公司），北京百威昂医药技术开发有限公司提供；胆固醇，上海伯奥生物科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），上海凌峰化学试剂有限公司；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 磷酸川芎嗪纳米脂质体的制备采用pH梯度法制备。取磷脂、胆固醇等溶于有机溶剂中，减压蒸发除去有机溶剂，加入柠檬酸溶液水化，间歇式超声，滤过，得空白脂质体。加入适量TMPP，用碱性溶液将外相pH值调至近中性，定容，置水浴中温育，即得。
2.2 TMPP纳米脂质体破膜溶剂的选择为保证脂质体含量测定的准确性，必需选用合适的溶剂系统使脂质体溶解，让药物从脂质体中完全释放出来。分别用甲醇、乙醇、异丙醇、Triton X-100醇溶液等溶剂单独或不同比例混合溶剂溶解脂质体溶液，结果5%Triton X-100醇溶液可溶解脂质体为澄清溶液，且得到的色谱峰峰形较好。因此，选其为破膜溶剂。
2.3 色谱条件色谱柱为phenomenex Luna C18(2)100A(4.6 mm×250 mm,5 μm)柱，phenomenex 保护柱；流动相为甲醇-水(3∶2)；流速1.0 ml/min；检测波长295 nm；柱温为室温。
2.4 方法专属性考察分别取TMPP溶液、空白脂质体用破膜溶剂溶解加水稀释所得的溶液、TMPP纳米脂质体用破膜溶剂溶解加水稀释所得的溶液进样20 μl，记录色谱图，结果辅料和溶剂对TMPP测定无干扰，TMPP保留时间约为5.2 min。
2.5 线性关系考察精密称取TMPP适量，加水溶解制成含量为40.8 μg/ml贮备溶液。精密量取上述溶液加水稀释成20.4，8.16，4.08，2.04，1.02，0.408 μg/ml浓度溶液。精密吸取贮备溶液及上述溶液各20 μl进样，以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=0.370 6X-0.040 67，r=0.999 9，表明TMPP在0.408~40.8 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
2.6 精密度实验 精密吸取浓度为4.08 μg/ml的TMPP溶液，连续进样6次，RSD为0.42%，精密度良好。
2.7 稳定性实验取同一供试品溶液0.1 ml于5 ml量瓶中，加入0.25 ml 5% Triton X-100醇溶液，再加水稀释至刻度，分别于0，2，4，6，8 h吸取20 μl，HPLC进样，RSD为0.11%。
2.8 回收率实验取空白脂质体1 ml 9份，分别精密加入1.5，2.0，2.5 ml的TMPP溶液（1.002 mg/ml）各3份，混匀。分别吸取0.1 ml于5 ml量瓶中，加入0.25 ml 5% Triton X-100醇溶液，加水稀释至刻度，吸取20 μl，HPLC测定，根据加入量和测得量，计算回收率。（见表1）。结果表明，低、中、高3种浓度平均回收率分别为98.47%，99.68%，98.23%，RSD分别为1.13%，0.74%，0.77%。
表1 回收率实验结果（略）
2.9 含量测定取供试液样品0.1 ml于5 ml量瓶中，加入适量5%Triton X-100醇溶液，加水稀释至刻度，吸取20 μl，HPLC测定。结果见表2。
表2 含量测定结果（略）
3 讨论
本文建立了HPLC法测定磷酸川芎嗪纳米脂质体中磷酸川芎嗪的含量。所用辅料、破膜溶剂对药物测定无干扰。方法简单、准确、重复性好，可用于磷酸川芎嗪纳米脂质体的含量测定。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］. 北京:化学工业出版社,2005：868.
［2］ 龚志南,徐莲英,宋经中,等. 盐酸川芎嗪对大鼠在体鼻粘膜吸收研究［J］. 中成药,2001,23(6):394.