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【摘要】 目的建立反相高效液相色谱法（RP－HPLC）测定黄杨宁片中环维黄杨星Ｄ的含量。方法环维黄杨星Ｄ与异氰酸苯酯反应后,用RP-HPLC测定,色谱柱为ODS-C18柱;流动相为甲醇－水(84∶16);检测波长：234 nm。结果衍生化反应在23.03~53.73 μg·ml-1浓度范围内线性良好，r=0.999 8（n＝5）,回收率均值96.1％,重复性好。结论该法准确,可靠，专属性强,可用于黄杨宁片中环维黄杨星Ｄ的质量控制。
【关键词】 黄杨宁片 环维黄杨星Ｄ 异氰酸苯酯 反相高效液相色谱法 衍生作用
Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for quantitative determination of Cyclovirobuxine D in HuangYangNing tablets. MethodsCyclovirobuxine D reacted with a derivative reagent phenyl isocyanate in chloroform.The analysis was carried out on C18 column,the mobile phase was methanol-water(86∶14),and the detection wavelength was at 234 nm.ResultsGood linearity was obtained from 23.03 μg·ml-1 to 53.73 μg·ml-1 of cyclovirobuxine D derivatives with a correlation coefficient of 0.999 8.The average recovery was 96.1%,RSD=1.5%.ConclusionThe method is accurate,reliable and specific and can be used for the quality control of Huangyangning tablets.
Key words：Huangyangning Tablets; Cyclovirobuxine D; Phenylisocyanate; RP-HPLC; Derivatization
黄杨宁片中主要成分为环维黄杨星Ｄ，环维黄杨星Ｄ系从黄杨科植物小叶黄杨Buxus minrophlla Sieb. et Zucc. var.SincaRehd. et Wils.及其同属植物中提取精制所得,主要用于冠心病及心绞痛的治疗。由于本品系从植物中经多次提取制备,原料中含有一定量的结构相似生物碱,《中国药典》原料用非水滴定法,片剂用酸性染料比色法, 测定的均为总生物碱,专属性差。根据其结构含仲氨基的特点,本文用异氰酸苯酯为衍生化［1］试剂,用高效液相紫外检测器方法测定黄杨宁片中环维黄杨星D的含量,现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器岛津UV-2401紫外可见分光光度计；Agilent1100高效液相色谱仪系统，包括四元泵系统，紫外检测器，色谱数据化学工作站。
1.2 制剂及对照品环维黄杨星D对照品，中国药品生物制品检定所提供， 批号110888-200202；黄杨宁片，江苏苏中药业集团股份有限公司生产（规格：1mg/片；批号060404，060406，060407），衍生化试剂异氰酸苯酯为Acros Organics，Belguim产品，色谱用水为蒸馏水，甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为岛津ODS C18柱(150 mm×4.6 mm)；流动相为甲醇-水(84∶16)；流速1.0 ml/min；检测波长234 nm；柱温为室温；进样量20 μl。
2.2 测定方法
2.2.1 衍生化试剂的配制精密吸取异氰酸苯酯20 μl，置10 ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 对照品溶液的制备取环维黄杨星D对照品10 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加衍生化试剂0.2 ml，摇匀，室温放置30 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品20片精密称定，研成细粉，精密称取适量（约相当于环维黄杨星D10 mg），置具塞锥形瓶中，加0.5％冰醋酸溶液40 ml，50℃加热超声（250 W，40 kHz）2 h，取出，放冷，离心6 min（3 000 r/min），小心倾取上清液，残渣加适量0.5％冰醋酸溶液充分洗涤，离心6 min（3 000 r/min），合并上清液及洗液，用氨水调pH值至9.0，转移至分液漏斗中，加三氯甲烷50ml振摇2 min，待溶液完全分层后，分取三氯甲烷层，用三氯甲烷湿润的试纸滤入圆底烧瓶中，再用三氯甲烷萃取3次（40，30，30 ml），分取三氯甲烷层，依次滤入烧瓶中，并用三氯甲烷洗涤滤纸，滤入烧瓶中，回收三氯甲烷至适量，转移至25 ml量瓶中，用三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置10ml量瓶中，加衍生化试剂0.2 ml，摇匀，室温放置30 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.4 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
2.2.5 测定波长的选择取对照品衍生化后，在200～400 nm波长范围内扫描，可见本品在230～240 nm波长范围内有较大吸收，且差异不大；最终采用234 nm作为本品含量测定的检测波长。
2.3 线性范围测定精密称取环维黄杨星D对照品10 mg，置25 ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，置10 ml量瓶中，各加衍生化试剂0.2 ml，摇匀，室温放置30 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取上述供试品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，测定线性范围，结果本品线性方程为：A= 94.933C+ 52.419，r=0.999 8（n＝5）。表明环维黄杨星D在 23.03～53.73μg·ml-1的浓度范围内，样品浓度（C）与峰面积（A）呈良好的线性关系。
2.4 重复性实验称取同一批号样品6份，照上述供试品溶液制备的方法制备6份，按上述色谱方法分别测定含量，结果RSD＝1.9％，重复性良好。
2.5 中间精密度取黄杨宁片，照上述供试液的制备方法，由3人，分3 d，分别在不同仪器上测定同一批样品含量，结果RSD＝1.5％，精密度良好。
2.6 稳定性实验精密吸取上述供试品溶液20 μl，分别于0，1，2，4，6，24 h时精密吸取溶液20 μl，按上述色谱方法测定含量，结果RSD＝0.5％，供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 加样回收率实验精密称取同一批已知含量的黄杨宁片样品5份适量，分别加入等量的环维黄杨星D对照品，按供试品溶液制备方法制样，照上述色谱方法测定含量，根据加入量和回收量计算回收率。结果见表1。
表1 黄杨宁片加样回收率实验结果（略）
结果表明：此方法回收率良好，符合测试要求。
2.8 3批样品含量测定结果取3批样品，分别按上述供试品溶液制备方法制备，照上述色谱方法测定含量，结果见表2。
表2 3批样品含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 衍生化反应条件的选择在实验过程中，对衍生化试剂用量、反应时间、反应温度进行了考察。结果表明衍生化试剂用量在0.15 ml以后，峰面积不再增加；反应30 min后，峰面积也不再增加，反应温度基本无影响，故最终选择加入0.2 ml衍生化试剂，于室温反应30 min，作为衍生化反应的条件。
3.2 黄杨宁片供试品溶液处理方法筛选根据本品环维黄杨星D溶解度项下，及本品原料提取工艺，通过实际试验，选择多种方法提取环维黄杨星D，结果表明，直接用甲醇或氯仿提取效率较低，而采用0.5％冰醋酸水溶液加热超声提取，然后用氨水调节pH值，用三氯甲烷多次萃取，效果较好。结合本品回收率实验，精密度实验，本法能满足本品含量测定要求。
本高效液相色谱法方法学研究表明，采用柱前衍生化方法，用紫外检测器即能准确测定本品含量，方法可靠，专属性强，便于控制质量。本品比色法含量测定结果和高效液相色谱法测定结果相差较大，结合本品原料含量测定结果可见，由于本品原料中含有一定量的结构相似生物碱，用非水滴定法含量达100.1％，而液相法测定含量仅为81.6％，可见本品非水滴定法不能完全反应本品原料中环维黄杨星D（C26H46N2O）的真实含量；而本品片剂采用酸性染料［2］比色法，测定的也为总生物碱，专属性不强，导致测定结果也不能反映环维黄杨星D的真实含量。
【参考文献】
［1］ 许新军，张正行，盛龙生，等.柱前荧光衍生化RP-HPLC测定环维黄杨星D含量［J］.药学学报，2002，37（5）：359.
［2］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：591.