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【摘要】 目的建立砂仁及其混淆品的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱鉴定方法。方法采用RP-HPLC（DAD）法，梯度洗脱，测定阳春砂、海南假砂仁及艳山姜的指纹图谱，并作相似度比较分析。结果砂仁及其混淆品的HPLC指纹图谱有明显差异。结论HPLC指纹图谱具有重现性好，特征性强，方法简便等特点，可用于砂仁与其混淆品药材的鉴别。
【关键词】 砂仁 混淆品 高效液相色谱 指纹图谱
Abstract：ObjectiveTo establish HPLC fingerprint for the identification of Amomum villosum and its adulterants.MethodsChromatographic fingerprint of Amomum villosum，Amomum chinense and Alpinia zerumbet was determined by RP-HPLC(DAD) and the gradient elution mode was applied in chromatographic separation,data were analyzed by Fingerprint Similarity Evalution Software to compare the similarity of samples. ResultsThere was an apparent difference in fingerprint between Amomum villosum and its adulterants. ConclusionHPLC fingerprint method is repeatable and feasible and can be suitable for identifying Amomum villosum and its adulterants.
Key words：Amomum villosum ; Adulterants; HPLC; Fingerprint
砂仁为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour.绿壳砂A. villosum Lour. var. xanthioides T. L. Wu et Sen jen 或海南砂A. longiligulare T. L. Wu 的干燥成熟果实［1］。具有化食开胃，温脾止泻，理气安胎之功效。近年来由于砂仁药材市场需求量大，各种混淆品也流入医药市场。李传印等［2］对砂仁的药材性状进行了鉴别研究。而采用HPLC指纹图谱鉴别砂仁与其混淆品的研究尚未见报道，本实验采用高效液相色谱法对砂仁与其混淆品指纹图谱鉴定进行了初步探讨，以期为砂仁质量控制和药材鉴别提供一些依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
砂仁购于贵州贵阳﹑四川成都、广东深圳等地，共10份样品，经笔者鉴定为姜科植物阳春砂Amomum villosum Lour. 的干燥成熟果实；海南假砂仁购于四川成都，经笔者鉴定为姜科植物海南假砂仁Amomum chinense Chun ex T.L.Wu的干燥成熟果实；艳山姜购于四川成都经笔者鉴定为姜科植物艳山姜Alpinia chinense Chun ex T.L.Wu的干燥成熟果实。
1.2 仪器与试剂
Agilent1100型高效液相色谱仪(自动进样品)，二极管阵列检测器(DAD)；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》(国家药典委员会)；槲皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111538-200301）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸镏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为Dikma公司Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm,5 μｍ）；流动相为乙腈（A）与0.1%磷酸（B）梯度洗脱，梯度条件0→11 min，A（%）0.5～5，B（%）99.5～95，11→61min，A（%）5～20，B（%）95～80，61→75 min，A（%）20～25，B（%）80～75，75→80 min，A（%）25～25，B（%）75～75；流速0.8 ml/min；柱温25℃；检测波长258 nm；参比波长360 nm；分析时间80 min；进样量10 μl。
2.2 供试品的制备精密称取药材细粉2.0 g，加石油醚（60～90℃）50 ml，超声15 min，滤过，残渣挥干溶剂，加甲醇50 ml回流1 h，滤过。残渣加甲醇50 ml，继续回流1h，滤过，合并两次滤液。置蒸发皿水浴挥干溶剂，残渣加甲醇溶解并定容至10 ml。用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品的制备精密称取槲皮苷对照品适量，加甲醇制成24.72 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
2.4 方法学考察以购于广东深圳的阳春砂药材为样品，对其稳定性﹑仪器精密度﹑重复性作了相应考察，结果证明稳定性及重复性良好。
2.4.1 精密度实验取同一份供试品溶液，重复进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度软件计算，在同一台仪器测得色谱指纹图谱的相似度分别为：0.986，0.992，0.991，0.981，0.982，0.972，均大于0.95。表明该仪器的精密度良好。符合指纹图谱检测要求［3］。
2.4.2 稳定性实验取同一份供试品溶液，分别在0，2，6，12，20，30h进行检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度软件计算，在同一台仪器测得色谱指纹图谱的相似度分别为：0.976，0.991，0.980，0.971，0.993，0.985，均大于0.95。表明在30 h内供试品溶液的成分是稳定的。符合指纹图谱检测要求［3］。
2.4.3 重复性实验取同一产地的供试品5份，同法检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度软件计算，在同一台仪器测得色谱指纹图谱的相似度分别为：0.981，0.955，0.965，0.973，0.979，均大于0.95。表明该方法的重复性较好，符合指纹图谱检测要求［3］。
2.5 指纹图谱建立精密吸取对照品与供试品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按选定的色谱条件，进行检测。同一实验条件下，测定所有供试品HPLC色谱图。根据不同供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数进行分析、比较，制定优化的指纹图谱见图1～3。
2.6.1 共有指纹峰标定比较购于贵州贵阳、四川成都及广东深圳共10批的阳春砂供试品溶液给出的相关参数，其中17个峰是各批供试品共有，因此确定这17个峰为其共有指纹峰，由于槲皮苷峰较小，保留时间靠后，没有选作为参照峰。
2.6.2 阳春砂指纹图谱相似度评价将购于贵州贵阳、四川成都及广东深圳的阳春砂样品测定数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，设定匹配模板，将峰自动匹配，然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出阳春砂HPLC指纹图谱共有模式，与共有模式比较，10个批次不同产地阳春砂药材的相似度：贵阳三桥药材市场①0.971，贵阳三桥药材市场②0.931，贵阳三桥药材市场③0.972，贵阳花果园药材市场①0.957，贵阳花果园药材市场②0.970 ，贵阳同仁堂药房0.967，贵阳芝林大药房0.971，深圳市中医院药房0.973，成都荷花池药材市场①0.974，成都荷花池药材市场②0.927。
2.6.3 阳春砂与海南假砂仁、艳山姜的指纹图谱比较从各自的指纹图谱中，可以直观地看出，阳春砂与海南假砂仁、艳山姜的指纹图谱明显不同，其特征峰数目、位置（相对保留时间）、积分值都有差异，海南假砂仁、艳山姜与阳春砂指纹图谱的共有模式相比，相似度结果分别为：0.806，0.219。
3 讨论
在色谱条件优化过程中，本研究主要考察阳春砂的色谱图，适当兼顾其它的色谱峰分离情况。经实验比较，用乙腈-0.1%磷酸溶液系统要比甲醇-0.1%磷酸溶液的系统分离度高，峰形对称性好，基线稳定。
本实验采用DAD分别在210，243，258，280 ，310 nm处检测以确定合适的检测波长。结果表明，低波长处基线漂移严重，而高波长处各组分的响应很小，故采用258 nm为检测波长。
实验中分别采用不同浓度的乙醇、甲醇对砂仁及其混淆品进行超声及回流提取考察，并作综合分析，拟定上述供试品的制备方法。
相似度分析结果表明，购于不同药材市场的阳春砂样品指纹图谱相似度较好，而阳春砂与混淆品海南假砂仁、艳山姜的指纹图谱具有明显差异。
本实验对砂仁HPLC指纹图谱的构建进行了初步探讨，可为砂仁药材的品种鉴定和质量评价提供参考依据。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:177.
［2］李传印,宋春华.砂仁的真伪鉴别［J］.时珍国医国药,2005,16（3）:225.
［3］国家食品药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)的通知》［S］.中国药品标准,2000,1(4):3.