高效液相色谱法测定余甘子药材中槲皮素的含量

　　【摘要】 　　目的建立余甘子药材中槲皮素含量测定的方法。方法HPLC法测定槲皮素含量。色谱柱为SHIMADZU VP-ODS (5 μm ，250 mm×4.6 mm)，保护柱为大连中汇达C18，流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液(含2.4 g·L-1庚烷磺酸钠)(50∶50)，流速1.0 ml·min-1，检测波长373 nm。结果进样量在0.02～0.20 μg范围内与色谱峰的峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 7)，余甘子药材平均加样回收率为97.3% ，RSD为0.99%(n= 6)。结论该方法操作简便、快速，有良好的精密度和准确性，可用于余甘子药材的质量控制。

　　【关键词】  余甘子； 槲皮素； 高效液相色谱法

　　AbstractObjectiveTo establish a method for determination of the content of quercetin in Phyllanthus emblica L..Methods Quercetin was quantitatively determined by high performance liquid chromagraphy(HPLC)．With SHIMADZU VP-ODS (5μm,4.6 mm×250 mm) column,a mixture of methanol and 0.4％ H3PO4（with 2.4 g·L-1 C7H15SO3Na）(50∶50) was used as mobile phase,the flow rate was 1 ml·min-1 and UV detection wavelength was at 373 nm． ResultsThe linear relationship was good within the range of 0.02～0.20 μg(r =0.9997)．The average recovery of Chinese medicinal plant Phyllanthus was 97.3% and the relative standard deviation was below 0.99% (n = 6)．ConclusionThe method is fast，simple，accurate and reproducible and can be used for the quality control of Phyllanthus emblica L.

　　Key wordsPhyllanthus emblica L.；  Quercetin；  HPLC

　　余甘子为大戟科叶下珠属(Phyllanthus)植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实。《云南省药品标准》《藏药标准》《中国药典》均收载。别称滇橄榄、橄榄、油甘子、望果；藏药称“久如拉”，傣药称“麻项帮”；古印度梵语称“庵摩勒”。在云南地区常作橄榄使用，还是藏族习用药材。味酸、甘、涩，主要用于治疗胃痛、肠炎、黄疸型肝炎、淋巴结核、高血压病等。研究表明余甘子具有抗氧化、抗癌、抗病毒、降血脂等作用［1］。余甘子主要含没食子酸(Gallic acid)；鞣花酸(Ellagic acid)；1-O-没食子酰基-β-D葡萄糖；3，6-二-O-没食子酰基-D-葡萄糖；诃子酸(Chebulinic acid)；槲皮素(Quercetin)；诃黎勒酸(Chcbtllagic acid)；鞣料云实精(Corilagin)；3-乙基没食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-benzoic acid)等，其中槲皮素主要以槲皮苷的形式存在。余甘子还含有大量维生素C(1.0%～1.8%)，且含量稳定［2］。本实验采用高效液相色谱法测定余甘子药材中槲皮素的含量。

　　1  仪器与试药

　　岛津LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器、CBM-102色谱数据处理机；槲皮素对照品由中国药品生物制品检定所提供，甲醇、庚烷磺酸钠为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为纯净水。

　　余甘子药材产地为云南省新平县平甸乡，春季采收干燥。经作者鉴定为大戟科叶下珠属植物余甘子Phyllanthus emblica L.的果实。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件

　　SHIMADZU VP-ODS (5 μm ，250 mm×4.6 mm)色谱柱，大连中汇达C18保护柱，甲醇-0.4％磷酸溶液(含2.4g·L-1庚烷磺酸钠)(50∶50)，流速1.0 ml·min-1；柱箱温度35℃，紫外检测波长373 nm，在上述条件下，样品中槲皮素与其它峰分离度大于2.0，理论塔板数达10 000以上，槲皮素峰拖尾因子在1.05～1.18之间，且样品中其它组分色谱峰无干扰，见图1。

　　2.2  对照品溶液的制备

　　取槲皮素对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成含槲皮素0.010 mg·ml-1的对照品溶液。

　　2.3  供试品溶液制备

　　取余甘子粉末(过40目筛)约5 g，精密称定，加入250 ml甲醇，加热回流1.5 h，回收甲醇，残渣精密加入甲醇-5%盐酸溶液(4∶1)的混合液25 ml，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm滤膜［3,4］，即得。

　　2.4  标准曲线与线性范围

　　精密吸取槲皮素对照品溶液2，4，6，10，14，20 μl进样测定，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样质量数(μg)为横坐标，进行线性回归计算，得回归方程：Y = 53 819X - 45 028 (r=0.999 7)，在0.02～0.20 μg范围内槲皮素有良好的线性关系。

　　2.5  精密度实验

　　精密吸取槲皮素对照品溶液10 μl，连续进样6 次，记录色谱图，槲皮素保留时间tR=15.512，其峰面积相对标准偏差RSD值为0.97%（n=6）。

　　2.6  重复性实验

　　分别取同一批余甘子药材按“2.3”项下方法制备供试品溶液5份，进样，记录色谱图，计算结果，药材中槲皮素含量的平均值为0.563 g，RSD值为0.89％。

　　2.7  供试品溶液的稳定性实验

　　取同一份余甘子药材供试品溶液，室温下，分别于0，2，6，10，14，18，24 h，进样7次，记录色谱图，其峰面积相对标准偏差RSD值为1.07%（n=7）。实验结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.8  加样回收率实验

　　取已知含量的余甘子粉末6份，每份5 g，精密称定，分别精密加入槲皮索对照品溶液(0.010 mg/ml)16 ml，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10μl，记录色谱图，结果余甘子的加样回收率为97.3%，RSD值为0.99%（n=6）。结果见表1。表1  槲皮素加样回收率结果（略）

　　2.9  样品的测定

　　称取余甘子药材5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别进样10 μl，作者采收的云南省新平县的余甘子药材中槲皮素含量为0.056 mg·g-1（n = 2），成都荷花池药材市场购买的川产余甘子药材中槲皮素含量为0.086 mg·g-1（n = 2）。结果见表2。

　　3  讨论

　　3.1  流动相的考察

　　曾考察过甲醇－水-磷酸（50∶50∶0.2）［5］，乙腈-水（36∶64）,（40∶60）,乙腈-0.4%磷酸（55∶45）,(50∶50）,(36∶64）,甲醇－0.4%磷酸（40∶60）,(45∶55）,（50∶50）［3］。以甲醇-0.4%磷酸(50∶50)系统对待测成分的分离效果较好。且加入庚烷磺酸钠在甲醇-0.4%磷酸（50∶50）系统下以每升流动相内含1.2 g时对峰形的改善效果达到最佳值。表2  余甘子中槲皮素含量测定结果（略）

　　3.2  检测波长的确定

　　在190～500 nm波长范围内进行紫外检测，槲皮素在373 nm波长处有最大吸收，在此波长处供试液中槲皮素与其他组分色谱峰得到较好分离。

　　3.3  样品测定前的处理

　　余甘子粉末极易吸湿，称量前可在60℃下干燥，经比较槲皮素未损失。《中国药典》2005年版对余甘子药材去核与否未作规定，实验所用的荷花池所售余甘子为去核的，而云南采集的余甘子并未做去核处理，结果显示四川产余甘子比云南产余甘子所测槲皮素含量高近1.5倍，且在槲皮素峰后多一小峰，可能与余甘子果核与余甘子果肉中槲皮素含量和化学成分组成的差异有关。

　　本实验首次采用高效液相色谱法对余甘子中槲皮素的含量进行测定，具有快速、简便、良好的精密度和准确性等优点，适用于余甘子药材的质量控制。

　　【参考文献】

　　［1］张兰珍，赵文华，郭亚健，等．藏药余甘子化学成分研究［J］.中国中药杂志，2003，28(10)：940.

　　［2］罗米娜,赵亮,刘霞,等.藏药独一味中槲皮素、木犀草素和芹菜素的HPLC测定［J］.药物分析杂志,2006.26(12):1773.

　　［3］张萌萌,杜守颖. HPLC测定滇白珠药材中槲皮素的含量［J］.中国中药杂志，2007.32(1):64.

　　［4］孙也之,王琳,刘振. 高效液相色谱法测定白花蛇舌草中槲皮素的含量［J］. 广东药学院学报，2007，23(1):5.

　　［5］薛珺,李凤仪.中草药中槲皮素测定方法的研究［J］.江西化工，2006，12:9.