点击显示 收起
【摘要】 目的测定吴茱萸水提物中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。方法采用碱性氯仿萃取处理样品，高效液相色谱（HPLC）法测定。色谱条件为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(体积比为49∶51)，检测波长225 nm，流速1.0 ml/min，柱温25℃，进样量20 μl。结果吴茱萸碱浓度在0.2～4.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系，r=0.999 7，平均回收率为101.50%，RSD=1.93%；吴茱萸次碱浓度在0.5～6.0 μg/ml内呈良好的线性关系，R=0.999 9，平均回收率为100.80%，RSD=0.72%。结论该方法简便、准确、分离效果好，可以用来测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。
【关键词】 吴茱萸碱；吴茱萸次碱；高效液相色谱
Abstract:ObjectiveTo determine the contents of evodiamine and rutaecarpine in the water extract of Fructus Evodiae. MethodsThe samples were extracted with NH3-CHCl3 and the contents were determined by HPLC. The extrated fluid was performed on Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5μm) column with the mobile phase of water-acetonitrile (49∶51) at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 225 nm. The column temperature was 25℃ and the injection volumn was 20 μl. ResultsEvodiamine had a linear range in the contents of 0.2 ～4.0 μg/ml，R =0.999 7. The average recovery was 101.50% and RSD was 1.93%；Rutaecarpine had a linear range in the contents of 0.5～6.0 μg/ml，R=0.999 9. The average recovery was 100.80%，and RSD was 0.72%.ConclusionThe method is convenient，accurate and satisfying in separating evodiamine and rutaecarpine．It can be used in determination of evodiamine and rutaecarpine in the water extract of Fructus Evodiae.
Key words:Evodiamine； Rutaecarpine； HPLC
吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.) Bench.的干燥近成熟果实，性味辛、苦，热，归肝、脾、胃、肾经，具有散寒止痛、降温止呕、助阳止泻等功能［1］。《本草纲目》中说：“茱萸性热，能散能温，苦热能燥能坚，故所治之症，皆取其散寒温中，燥湿解郁之功而已。”目前对吴茱萸有效成分的药理活性研究，主要集中在几种有效成分上，如吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱等［2］。临床实验表明，吴茱萸生物碱包括吴茱萸碱(Evodiamine)和吴茱萸次碱(Rutaecarpine)等的含量与它的疗效有正相关关系［3］，因此研究吴茱萸中生物碱的含量测定有一定的意义。但HPLC直接测定吴茱萸的水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，不能基线分离。针对此问题，本实验采用碱性氯仿萃取处理样品，HPLC测定其中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。通过测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量，从而为研究吴茱萸与中药热性的关系提供一定的评价标准。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent1100 G1311A 四元梯度泵、Agilent1100G1314A VWD检测器、7725i手动进样器、Agilent1100 工作站(Agilent 公司)；SHZ-D(III)型循环水式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；KQ-250VDB双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。乙腈为色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司产品(批号200610050)；甲醇为色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司产品(批号2006090306)；水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
吴茱萸药材购于浙江缙云（批号为20061003）。吴茱萸碱购于中国药品生物制品检定所(批号110801-200505)，吴茱萸次碱购于中国药品生物制品检定所(批号110802-200504)。
2 方法与结果
2.1 色谱及检测条件
参照文献［4］的色谱条件改进。色谱柱为20RBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(49∶51)；检测波长225 nm；流速1.0 ml/min；进样量20 μl；柱温25℃。
2.2 对照品溶液的制备
2.2.1 吴茱萸碱对照品溶液精密称取吴茱萸碱对照品5 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作母液。精密量取5 ml母液至25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得0.04 mg·ml-1吴茱萸碱对照品溶液。按“2.1”项的色谱条件进行HPLC分析测定，得到相应的色谱图。见图1。
2.2.2 吴茱萸次碱对照品溶液精密称取吴茱萸次碱对照品5 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作母液。精密量取5 ml母液至25 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得0.04 mg·ml-1吴茱萸次碱对照品溶液。按“2.1”项的色谱条件进行HPLC分析测定，得到相应的色谱图。见图2。
2.3 吴茱萸水提物的制备将称得的6 623.2 g吴茱萸生药材，干燥、去杂质，捣碎，浸泡30 min，加10倍量的蒸馏水，浸泡保持微沸1 h，第2次加8倍量的蒸馏水，保持微沸1 h，合并两次提取液，浓缩至5 000 ml，即得吴茱萸的水提物。
2.4 供试品溶液制备
精密称取1.000 g吴茱萸的水提物，加水溶解稀释至4 ml，加氨水调pH至9.5～10，用氯仿萃取，共萃取3次，15 ml/次，合并萃取液并蒸干，甲醇溶解并用25 ml容量瓶定容，取一定量，稀释10倍后，过0.45 μm微孔滤膜，即得。按“2.1”项的色谱条件进行HPLC分析测定，得到相应的色谱图，见图3。
2.5 线性范围的考察
2.5.1 吴茱萸碱的线性范围考察
分别精密吸取“2.2.1”项下0.04 mg·ml-1吴茱萸碱对照品溶液，配成以下终浓度进样：0.2,0.4,1.0，2.0，4.0 μg/ml，进样量均为20 μl，以峰面积值为纵坐标，吴茱萸碱的浓度为横坐标，回归处理得回归方程为：Y = 193.17X +2.515 6，r= 0.999 7，结果表明吴茱萸碱浓度在0.2～4.0μg/ml范围内呈良好的线性关系。
2.5.2 吴茱萸次碱的线性范围考察
分别精密吸取“2.2.2”项下0.04 mg·ml-1吴茱萸次碱对照品溶液，配成以下终浓度进样：0.5 ，1.0，2.0，4.0，6.0 μg/ml，进样量均为20 μl，以峰面积值为纵坐标，吴茱萸次碱的浓度为横坐标，回归处理得回归方程为：Y =198.26X -65.479，r=0.999 9，结果表明吴茱萸次碱浓度在0.5 ～6.0 μg/ml范围内呈良好的线性关系。
2.6 精密度实验取同一浓度的吴茱萸碱对照品溶液，在上述色谱条件下测定吴茱萸碱峰面积，重复进样6次，结果RSD=1.37%(n =6)；取同一浓度的吴茱萸次碱对照品溶液，按“2.1”项色谱条件测定吴茱萸次碱峰面积，重复进样6次，结果RSD=1.51%(n=6)。
2.7 重复性实验按照“2.4”项供试品溶液制备的方法处理样品6份，按“2.1”项色谱条件下分别测定，每份进两针，取平均值计算：吴茱萸RSD=1.24%(n =6)；吴茱萸次碱RSD=1.45%(n =6)。
2.8 加样回收率实验 精密称取1.000 g吴茱萸的水提物，加水溶解稀释至4 ml，精密加入一定量的吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品溶液，平行做3份，加氨水调pH至9.5～10，用氯仿萃取，共萃取3次，15 ml/次，合并萃取液并蒸干，甲醇溶解并定容至25 ml，取一定量，稀释10倍后，过0.45 μm微孔滤膜，即得，进样量为20 μl，按“2.1”项色谱条件下分别测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量，结果吴茱萸碱平均回收率为101.50%，RSD=1.93%；吴茱萸次碱平均回收率为100.80%，RSD=0.72%。结果见表1。表1 吴茱萸碱和吴茱萸次碱加样回收率实验结果（略）
2.9 样品测定
按照“2.4”项供试品溶液制备的方法处理样品3份，按“2.1”项色谱条件下分别测定吴茱萸碱、吴茱萸次碱含量。结果见表2。表2 吴茱萸的水提物中吴茱萸碱与吴茱萸次碱的总量（略）
3 讨论
用吴茱萸的水提取液直接按“2.1”项色谱条件测定，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的峰形均达不到基线。对于溶液状的样品，且待测物为脂溶性，优先选用有机溶剂萃取的方法处理样品。选用碱性氯仿［5～6］、醋酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇［7］分别对吴茱萸的水提液在相同条件下萃取。结果，对于萃取水溶液中吴茱萸碱和吴茱萸次碱，萃取效率最高为碱性氯仿，其次为醋酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇。碱性氯仿提取效率最高，因此测定吴茱萸的水提取液中的吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量采用碱性氯仿萃取的方法进行处理，且萃取4次后检测不到吴茱萸碱及吴茱萸次碱色谱峰，所以萃取次数确定为3次。本方法简便、准确、分离效果好，可以用来测定吴茱萸水提物中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的含量。
【参考文献】
［1］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：138.
［2］战光绪，吴大正，胡之璧．吴茱萸有效成分的药理研究进展［J］.上海中医药杂志，2006， 40 (2):62.
［3］于静华，刘春禹，吕小丹，等.吴茱萸药理研究进展［J］.吉林中医药，2005，25（2）：53.
［4］夏玉凤，戴 岳，张艳立.疏毛吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量的动态变化［J］.中国野生植物资源，2006，25(1) ：53.
［5］许石钟，王瑞锋，余行俭．不同吴茱萸炮制品的质量比较［J］.时珍国医国药，2002，13（l）：22.
［6］邹巧根，周世旺，宋 喆,等．反相HPLC法测定吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量［J］.中国药科大学学报，1996，27（9）：537.
［7］甄攀，张荣山，白雪梅，等．吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取条件研究［J］.中国药学杂志，2005，40 (2)：99.