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【摘要】 目的建立用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定补气养血口服液中黄芪甲苷的含量测定方法。方法采用Kromasil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈－水（32∶68）；流速为1.0 ml·min-1；柱温：40℃；ELSD参数：漂移管温度100℃，氮气流速：2.5 ml·min-1。结果黄芪甲苷在2.248～11.240 μg范围内线性关系良好，r＝0.999 6；平均回收率99.8%，RSD为1.2%。结论该方法简便、准确，重复性好，适用于补气养血口服液的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱 蒸发光散射检测法 黄芪甲苷 补气养血口服液
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC-ELSD method for determination of astragaloside IV in Buqiyangxue Oral Liquor. Methods The chromatographic coniditions included the Kromasil ODS-C18 (4.6 mm×250 mm, 5μm) chromatographic column and mobile phase consisted of acetonitrile-water (32∶68), the flow rate was 1.0 ml·min-1. Column temperature was 40℃,ELSD parameter; drift tube temperature was 100℃ and the flow rate of nitrogen was 2.5 ml·min-1.ResultsAstragaloside IV showed a good linearity with the range from 2.248～11.240 μg, r=0.999 6; the average recovery was 99.8% with RSD 1.2%.ConclusionThe method is simple, reproducible, and it can be used for the quality control of Buqiyangxue Oral Liquour.
Key words：HPLC-ELSD; Astragaloside IV; Buqiyangxue Oral Liquor
补气养血口服液由黄芪、大枣、枸杞、麦冬等中药制成，具有补脾益气的功能［1］。黄芪是君药，其主要成分为黄芪甲苷，控制黄芪的质量，即可控制本品的质量。有关黄芪甲苷的分析方法报道，有薄层-紫外分光光度法、薄层扫描法等。但大部分是测定生药及其制剂中的黄芪甲苷，用于测定中药口服液报道较少。补气养血口服液为液体制剂，药物吸收快，作用迅速，且易于分剂量，服用方便，特别适用于儿童和老年患者。为了更好地控制成品的质量，在原标准的基础上，对补气养血口服液中黄芪甲苷的质量标准进行了详细的研究，增加了高效液相色谱-蒸发光散射检测器测定黄芪甲苷的含量［2］，并进行了方法学考查。
1 仪器与试药
1.1 仪器
惠普HP1100系列液相色谱仪美国安捷伦公司，Alltech—ELSD蒸发光散射检测仪（美国奥泰公司）。
1.2 试药
黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：110781-200512；规格：20 mg），补气养血口服液样品（武汉联合药业有限公司提供，批号20050301；规格10 ml/支），实验中所用试剂水为重蒸馏水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Kromasil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；Chemstate色谱工作站；流动相为乙腈－水（32∶68）；流速为1.0 ml·min-1；柱温：40℃；ELSD蒸发光散射检测器检测参数：漂移管温度100℃，氮气流速：2.5 ml·min-1。理论板数按黄芪甲苷峰计应不低于3 000［3］。在该色谱条件下对照品、样品和阴性对照品的色谱图分别见图1～3。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥24h黄芪甲苷对照品适量精密称定，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的对照品溶液，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液精密量取本品25 ml，用水饱和的正丁醇振摇提取4次,20 ml/次，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，20 ml/次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 ml使溶解，放冷，通过D101型大孔树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），以水50 ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇50 ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 阴性（缺黄芪）对照溶液取缺黄芪的阴性样品约25 ml，精密称定，按供试品溶液的制备项下的方法操作，得阴性对照液。
2.3 专属性考察实验按上述仪器和实验条件，将供试品溶液、阴性对照溶液、黄芪甲苷对照品溶液分别注入液相色谱仪测定。结果供试品色谱图中有与对照品相同的保留时间，且基线平稳、分离度好，而阴性对照在此保留时间无色谱峰。
2.4 标准曲线的制备精密吸取对照品溶液（浓度为0.562 mg/ml）4，8，12，16，20 μl，分别注入液相色谱仪，依照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积的自然对数值为纵坐标，黄芪甲苷进样量的自然对数值为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y＝1.1317X＋6.3959，r＝0.999 6。结果表明，黄芪甲苷在2.248～11.240 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度实验取同一供试品溶液，重复进样6次，结果RSD=0.9%(n=6)。
2.6 重复性实验取20050301批样品的同一份供试品溶液,按含量测定方法,连续进样6次，以黄芪甲苷的峰面积计算，结果RSD＝1.05%。表明本方法重复性较好。
2.7 稳定性实验精密量取本品25 ml，照供试品溶液的制备项下的方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μl，分别于0，2，4，6，8 h注入液相色谱仪中，分别测定黄芪甲苷的峰面积，结果RSD＝0.96%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
2.8 加样回收率实验取已知含量的样品（87.20 μg/ml）7份，精密量取15 ml，每份分别精密加入对照品溶液（含黄芪甲苷0.562 mg/ml）2.0 ml，照黄芪甲苷含量测定法分别测定黄芪甲苷的含量，并计算回收率，结果黄芪甲苷的平均回收率为99.8%，RSD为1.2%，表明本法具有良好的回收率。结果见表1。表1 回收率实验结果 （略）
2.9 含量限度的制定分别精密吸取对照品溶液10，20 μl和供试品溶液20 μl，注入高液相色谱仪，照上述色谱条件测定，以外标两点法对数方程计算含量，即得。7批样品测定结果见表2。
表2 补气养血口服液中黄芪甲苷含量（略）
表中7批样品黄芪甲苷的平均含量为76.49 μg/ml，考虑大生产的差异，按平均含量的75%计算，规定本品每毫升含黄芪甲苷（C41H68O14）不得少于60 μg。
3 讨论
供试品溶液的制备方法，参考了2005年版《中国药典》Ⅰ部［1］黄芪项下含量测定方法：将样品用以水饱和的正丁醇振摇提取5次，20 ml/次，合并1～4次正丁醇液，第5次正丁醇液另器保存，以下操作同前面供试品溶液的制备方法。将1～4次合并液及第5次正丁醇提取液分别进行黄芪甲苷的含量测定，结果表明：样品用正丁醇提取4次，即可提取完全。目前，黄芪甲苷测定方法有薄层扫描法，但误差较大。又由于皂苷为一类极性较大，结构复杂的化合物，它只在紫外末端有吸收，若采用紫外检测末端吸收法（200～210 nm），则有干扰峰，无法使用。因此我们采用蒸发光散射检测仪（ELSD）作为检测手段，利用HPLC法测定补气养血口服液中黄芪甲苷的含量。实验操作简便，且精密度高，准确度较高，是控制黄芪甲苷含量一种较好的分析方法。
【参考文献】
［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：249.
［2］周春玲.高效液相色谱-蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.中国中药杂志，2000，25（3）：166.
［3］朱洁，温敏，张洪彬.HPLC-ELSD测定三七胶囊中人参皂Rg1和Rb1［J］.中成药，2004，26（1）：33.