高效液相色谱法测定乐山栀子熊果酸含量

　　【摘要】 　　目的为控制乐山栀子的质量，建立高效液相色谱法测定乐山栀子中熊果酸含量的方法。方法采用高效液相色谱法，以熊果酸为化学对照品，固定相：UltimateTM C18键合硅胶柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相：甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06），流速0.6 ml·min-1，温度25℃，波长210 nm测定乐山栀子熊果酸含量。结果熊果酸在0.1～3.0 μg范围内峰面积A与其质量M呈现良好的线性关系，其回归方程为： A＝－12 954.882 9＋452 850.960 3 M，r＝0.999 6，n＝7；3批乐山栀子中熊果酸的含量分别为（0.255 5±0.001 6）mg·g-1药材，RSD＝0.622 1%，n＝4；（0.265 825±0.003 491）mg·g-1药材，RSD＝1.313%，n＝4；（0.258 875±0.006 198）mg·g-1药材，RSD＝2.394%，n＝4；精密度实验RSD＝1.754%，仪器精密度良好；稳定性实验RSD＝3.493%,在3.5 h测定熊果酸的含量是稳定的；重现性实验RSD＝0.905 1%，平均回收率101.9%。结论高效液相色谱法适合乐山栀子中熊果酸的含量测定，该方法操作简便，结果稳定，精密度、重现性、回收率较好，值得推广。

　　【关键词】  乐山栀子；熊果酸；含量测定；高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish the method of determining the cotent of ursolic acid in Fructus Gardeniae by HPLC.  MethodsHPLC was used to determine the content of Ursolic acid in Fructus Gardenice ursolic acid as the standard, Solid phase: UltimateTM C18 (4.6 mm×250 mm，5   μm), Liquid phase∶Methyiaicohol∶Water∶Acetic acid∶Triethylaminum (90∶10∶0.03∶0.06), Flow rate：0.6ml·min-1，temperature：25℃,wavelength：210 nm.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.1～3.0μg, and the return formula was A＝－12954.882 9＋452 850.960 3 M, r=0.999 6,n＝7,  the contents of ursolic acid in Frctus Cardeniae were （0.255 5±0.0016）mg·g-1，RSD＝0.622 1%，n＝4；（0.265 825±0.003 491 ）mg·g-1，RSD＝1.313%，n＝4；（0.258 875±0.006 198）mg·g-1，RSD＝2.394%，n＝4, respectively. Precision RSD＝1.754%,stablity RSD%＝3.493，repeatability RSD＝0.9051%，recovery rate was 101.9%.ConclusionHPLC is suitable for the determination of ursolic acid in Fructus Gardeniae from Leshan city. This method is simple, the result is stable and has good repeatability,recovery and precision. It can be widely used for the quality control of Fructus Gardeniae.

　　Key words：Fructus Gardeniae from Leshan city；  Ursolic acid;  Content determination；  HPLC

　　栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，主产于浙江、四川、江西、重庆、湖北等省。栀子具有泻火除烦、清热、凉血解毒之功效，用于热病心烦、黄疸、尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮痈等证。根据现代药理研究证实，熊果酸为栀子重要有效成分，具有显著而迅速降低谷丙转氨酶，消退黄疸，增进食欲和恢复肝功能的作用，这在茵栀黄注射液、茵陈蒿汤等方剂中得到广泛的应用。栀子治疗急性黄疸型肝炎、病毒性肝炎主要是通过其有效成分熊果酸实现的,熊果酸是栀子利胆退黄、抗病毒性肝炎的主要有效成分。栀子熊果酸还具有解热降温、抗炎、抗肿瘤等活性。有报道表明，栀子苷的生理活性有限，其利胆作用、保护肝损伤、降低转氨酶方面均不及栀子中熊果酸明显，而且栀子苷分子中双键性质活泼，不稳定，易发生反应。相比而言，栀子熊果酸受热更稳定，因此控制栀子熊果酸含量具有非常重要的质量评价意义［1～6］。本研究通过高效液相色谱法测定乐山栀子熊果酸含量，为建立乐山栀子质量新标准提供参考。

　　1 仪器与材料

　　SSI高效液相色谱仪；UltimateTM C18键合硅胶柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；AS3120A Ultrasonic Cleaner；AP-01P真空泵；Haier BCD-176DA电冰箱；SHH V21型长风三用电热恒温水浴箱；ZK072型电热真空干燥箱；RE-52B型旋转蒸发器；AS 701KDT Ultrasonic Cleaner；UV-9200型紫外可见光分光光度计；FA1104W电子天平； Sh10A型水份快速测定仪；50目分样筛； Kodak Easy share Z7590数位相机；CASIO fx-4800p电子计算器；冰醋酸、甲醇、三乙胺为分析纯，色谱纯甲醇；熊果酸化学对照品（110742-200516,约20mg,供含量测定用）（中国药品生物制品检定所）、栀子产自四川乐山（经课题组鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实）。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件固定相：UltimateTM C18键合硅胶柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为甲醇∶水∶冰醋酸∶三乙胺（90∶10∶0.03∶0.06）；流速0.6 ml·min-1；温度25℃；波长210 nm［7］。

　　2.2 栀子熊果酸提取条件优选以药材粒径、甲醇加入量、超声提取时间、超声提取次数4因素3水平，以熊果酸收率为指标，选用L9（34）正交表优选栀子熊果酸提取条件为：栀子药材粉碎为50目粉末，加入甲醇量为药材量的5倍，每次超声提取60 min，超声提取3次，可使熊果酸收得率达到最大，且经济合理，将另文报道。

　　2.3 熊果酸标准曲线绘制［8］精密称取熊果酸化学对照品2.0 mg（60℃减压干燥24 h），用无水甲醇定容于10 ml容量瓶中，即得0.2 mg·ml-1的熊果酸对照品溶液。熊果酸在0.1～3.0 μg范围内峰面积A与其质量M呈现良好的线性关系，其回归方程为：A＝－12 954.882 9＋452 850.960 3 M， r＝0.999 6，n＝7。

　　2.4  精密度实验精密吸取上述熊果酸对照品溶液10 μl，其积分面积RSD＝1.754%，n＝5，表明该方法、该仪器测定熊果酸精密度符合要求。

　　2.5  稳定性实验精密吸取上述熊果酸对照品溶液10 μl，每隔30 min测定1次，其积分面积RSD＝3.493%，n＝5。表明熊果酸用该方法在该仪器上3.5 h内测定结果较稳定，符合要求。

　　2.6  栀子熊果酸含量测定重现性实验照前面“2.2”项栀子熊果酸的提取工艺，测得栀子熊果酸含量RSD＝0.905 1%，表明该方法重现性实验符合要求。

　　2.7  栀子熊果酸加样回收率实验照前面“2.2”项栀子熊果酸的提取工艺提取，取该溶液2 ml，加入上述熊果酸对照品溶液0.3 ml，平均加样回收率为101.9%，表明该方法测定栀子熊果酸的加样回收率符合要求。

　　2.8  3批乐山栀子熊果酸含量测定按照“2.2”项的提取条件提取3批乐山栀子熊果酸，按照上述测定条件分别测定熊果酸含量，测定结果见表1［9］。

　　3 讨论

　　经过采集乐山、云南、贵州、湖南、河南等地的栀子并测定熊果酸含量，发现乐山栀子含量最高，证实其确为质量优良的正宗川栀子。

　　实验发现，上述熊果酸对照品溶液积分面积为1.5×105～2.5×105，峰高为6×103～7×103，理论塔板数约1.2×104时，峰高法计算结果与真实值的误差为1.240%，积分面积计算结果与真实值的误差为1.415%，表明峰高法比积分面积法更接近真实值，尤其适用于熊果酸峰与齐墩果酸及其衍生物峰未完全分开时。考虑到乐山栀子中熊果酸峰与齐墩果酸及其衍生物峰完全分开，而且峰高法计算结果与峰面积法计算结果无显著性差异，出于习惯考虑，本文仍采用峰面积法测定乐山栀子熊果酸的含量。表1  乐山栀子熊果酸含量(略)

　　冰醋酸主要用于改善熊果酸与齐墩果酸及其衍生物图谱分离度，由于冰醋酸具有挥发性，对熊果酸与齐墩果酸及其衍生物图谱分离度存在一定程度的波动，通过反复实验，才得到较成功的图谱。若改用不具有挥发性的磷酸，则能改善熊果酸与齐墩果酸及其衍生物图谱分离度的波动性，可能更容易成功，有待于进一步研究。

　　熊果酸提取温度最好在60℃以下，样品溶液置于0℃冰箱中贮存，测定时分析室的温度控制在25℃左右，以避免熊果酸分解对结果造成影响。

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