高效液相色谱法检测加味芍药甘草颗粒中芍药苷、甘草酸的含量

　　【摘要】 【目的】建立加味芍药甘草颗粒中芍药苷及甘草酸的含量测定方法。【方法】采用反相高效液相色谱法，色谱条件：乙腈(A)-10g/L冰醋酸水溶液(B)(调pH35)，流速10mL/min；检测波长250nm,柱温为室温，进样量20μL。梯度洗脱程序：体积分数18%A、0~5min，体积分数19%~29%A、6~10min，体积分数30%~45%A、11~25min(A+B=100%)。【结果】芍药苷及甘草酸分别在1916～1226、2625～168μg/mL范围内成良好线性关系,平均回收率芍药苷为10112%，甘草酸为9968%。【结论】本测定方法简便可行、重复性好，可用于加味芍药甘草颗粒中有效成分芍药苷和甘草酸的含量测定。

　　【关键词】  加味芍药甘草颗粒/化学；芍药苷/分析；甘草酸/分析；色谱法，高压液相

　　芍药甘草汤系《伤寒论》著名方剂，由芍药、甘草等份组成。该方为仲景为伤寒误汗亡阳、阳复后脚挛急证而设，奏柔肝舒筋、缓急止痛之效，具有明显的镇痛、抗炎、解痉、止咳、平喘、抗变态反应作用，广泛应用于呼吸系统、消化系统、神经肌肉系统、泌尿系统及外科和妇科等方面的疾病［1］。研究表明，芍药苷及甘草酸为芍药与甘草中的主要有效成分［2-3］。而以芍药、甘草为主的衍化方较多，该类制剂的指标成分主要是芍药苷、甘草酸，有关单独测定这两类成分方法的文献报道较多，目前尚未见到同时测定芍药甘草汤颗粒中芍药苷与甘草酸含量的报道。加味芍药甘草颗粒是以芍药甘草汤为基本方的中成药，本文采用高效液相色谱法(HPLC)同时检测该方中芍药苷和甘草酸的含量，结果报道如下。

　　1 仪器与试药

　　11仪器Summit P680A型高效液相色谱仪、 Summit P680A型低压四元泵、PDA100 ASI100自动进样器、Summit 柱温箱以及“变色龙”色谱工作站均由德国戴安中国有限公司提供；Sartorius十万分之一电子天平由德国赛多利斯公司提供。

　　12 药物与试剂加味芍药甘草汤颗粒（批号分别为20070217、20070520、20071023）购自天津泰达药业有限公司；芍药苷和甘草酸对照品均购于中国药品生物制品检定所(批号分别为110736200629、110731200408)；乙腈为色谱纯；冰醋酸为分析纯。

　　2方法和结果

　　21色谱条件色谱柱：Diamonsil C18(46mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-10g/L冰醋酸水溶液(B)(调pH 35);流速为10mL/min；检测波长为250nm；柱温为室温；进样量20μL。梯度洗脱程序：体积分数 18%A、DISEASE MODELS, ANIMAL; RATS0~5min，体积分数19%～29%A、6～10min，体积分数30%～45%A、11～25min(A+B=100%)。在此条件下芍药苷、甘草酸与其他组分能达到较好分离，分离度均大于15，理论塔板数均大于5 000（见图1～4）。

　　22标准品溶液的制备及线性关系的考察精密称取芍药苷对照品1226mg置10mL量瓶中，用体积分数35%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1226mg/mL的芍药苷对照品贮备液；精密称取甘草酸对照品84mg置25mL量瓶中，用体积分数35%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为0336mg/mL的甘草酸对照品贮备液。精密量取芍药苷对照品贮备液10mL、甘草酸对照品贮备液50mL置10mL量瓶中，用体积分数35%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成含芍药苷、甘草酸质量浓度分别为01226、0168mg/mL的混合对照品溶液，作为线性1号工作液。

　　23供试品溶液的制备精密称取加味芍药甘草颗粒粉末10g。置100mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇250mL，密塞，称定质量，超声提取30min，室温放置30min后，以甲醇补足损失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10mL置10mL量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

　　24阴性对照品溶液的制备阴性对照溶液的制备按照22项下方法分别制备缺白芍、缺甘草的加味芍药甘草颗粒阴性样品。

　　25精密度试验取对照品溶液重复进样6次，每次20μL。测得芍药苷、甘草酸峰面积sR分别为093%、075%。

　　26稳定性试验精密吸取供试品溶液20μL，重复进样6次，每次间隔2h，测得芍药苷、甘草酸峰面积sR分别为055%、062%，结果表明样品中芍药苷、甘草酸在12h内稳定。

　　27重复性试验按拟定的含量测定方法，取同一样品溶液（批号：20060217），平行制备6份，测得峰面积并计算含量，结果测得芍药苷、甘草酸含量的sR分别为097%、109%。

　　28加样回收率试验分别精密称取6份已测得芍药苷、甘草酸含量的加味芍药甘草颗粒（批号：20060217）各1g，加入芍药苷、甘草酸对照品液，混匀，按照23项下供试品溶液制备方法制备，进样分析计算结果。结果表明芍药苷、甘草酸的平均回收率分别为10112%(sR为106%)、9968%(sR为109%)，结果见表1、表2。表1 芍药苷加样回收率试验表2 甘草酸加样回收率试验

　　29含量测定结果按供试品溶液制备方法和色谱条件对3批样品进行了测定，结果见表3。表3样品含量测定结果

　　3讨论

　　《中国药典》以流动相：甲醇－02mol/L醋酸铵溶液－冰醋酸（67∶33∶1）超声提取得甘草酸，以稀乙醇超声提取芍药苷［4］。在预试验中，我们对比3种溶剂体系及经过不同的提取时间（20、30、40、60min）所提取的成分与含量，结果表明，超声提取30min（功率240W，频率45kHz）后，延长提取时间并不能增加含量，甲醇与本实验的流动相要比稀乙醇提取的成分与含量多，而甲醇与流动相之间基本无差别。从操作简便角度考虑，确定以甲醇超声提取30min；回收率结果表明，该法可将2种指标成分提取完全。由于芍药苷与甘草酸流动相的极性相差较大［4］，为了能同时分析2个成分，我们参考相关文献，经调整后，选择了梯度洗脱。故选择乙腈-10g/L冰醋酸(调pH 37)作为流动相［5-6］。结果显示，该流动相分离效果良好：出峰时间适宜，阴性无干扰，样品峰形和分离效果好。目前中成药的质量控制标准多为单成分、单指标的含量控制，虽有的为有效成分，但实际上也只是指标性地控制，不能表达其整体的质量，达不到以“量”控制“质”的目的。在同一方剂中，药味的不同配伍比例对指标成分体内药动学特征及复方药效具有显著影响，所以复方中药各指标成分含量及其比例不仅可以反映制剂工艺水平，而且可以表征和保证复方中药(及其制剂)的药效。本研究建立了同时测定加味芍药甘草颗粒中芍药苷与甘草酸含量的方法，该法具有操作简便、结果可靠等特点，能够应用于加味芍药甘草颗粒及相关制剂的质量评价与质量控制。

　　【参考文献】

　　［1］曹艳，旺建伟，段淑香，等. 芍药甘草汤临床及药理研究近况［J］.中医药信息，2006，23（3）：41.

　　［2］ 胡 南，许惠玉，陈志伟.芍药苷的药理学研究进展［J］.齐齐哈尔医学院学报，2007，28(9):1093.

　　［3］ 李斌霞，佟 杰.甘草酸药理作用及机制的研究进展［J］.数理医药学杂志，2007，20(2):228.

　　［4］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典2005版(一部)［S］．北京：化学工业出版社，2005:59，69.

　　［5］ 蒋 晔，郝福，李艳荣，等.HPLC同时测定桂枝颗粒中桂皮酸、芍药苷、甘草酸含量［J］.中国中药杂志，2008，33（2）：204.

　　［6］ 杨玲娟，赵晓莉，狄留庆，等.HPLC法测定芍药甘草汤总有效部位中4个活性成分的含量［J］.中华中医药学刊，2007，25（3）：523.